Identification and characterization of specific Caspase-1 and IL1R inhibitors

Abstract

Otoinflamatuar hastalıklar doğuştan gelen bağışıklık sisteminin anormal olarak aktive olması sonucu ortaya çıkarlar. Bu hastalıklar batılı ülkelerdeki nüfusun yüzde beşinden daha fazlasını etkilemektedirler ve toplamda seksenden daha fazla çeşidi bulunmaktadır. Özellikle İnterleükin-1 alfa ve İnterleükin-1 beta başta olmak üzere, miktarı fazlaca yükselmiş İnterleükin-1 sitokinleri, Behçet Hastalığı ve Ailevi Akdeniz Ateşi gibi bir çok otoinflamatuar hastalık çeşidinde görülmektedir. IL1β sitokini İnterleükin-1 reseptörüne bağlandıktan sonra NLRP3 (Kriyopirin) inflamazomu aktive olur. Anormal derecede IL1R sinyalizasyonu ve akabindeki NLRP3 (Kriyopirin) inflamazom aktivasyonu otoinflamatuar hastalıkları tetiklemektedir. Bu kritik rolü göz önüne alındığında inflamazom aktivasyonunu azaltmayı hedefleyen bir kaç tedavi seçeneği bulunmaktadır. Kaspaz-1 inhibitörleri (henüz FDA onayı alamamış), IL1R antagonistleri ve anti-IL1β antikorları bu yöntemlerden bazılarıdır. Fakat bilinen tedavi yöntemleri protein bazlı olduğundan, pahalıdırlar ve günlük ya da haftalık enjeksiyon gerektirmektedirler. Küçük molekül inhibitörleri daha ucuz yöntemlerle üretilebilir ve hap yoluyla enjeksiyona ihtiyaç duymadan daha uygun koşullarda uygulanabilirler. Ancak şu ana kadar tanımlanmış herhangi bir IL1R küçük molekül inhibitorü bulunmamaktadır. Bu yüzden, bu tezin amacı küçük molekül inflamazom inhibitörlerini keşfetmek, tanımlamak ve karakterize etmektir. IL1R sinyalizasyonunu hedefleyen küçük molekül inhibitörlerini geliştirebilmek için, bilgisayar modellemeleri ve bilinen ilaçların yeniden amaçlanması yöntemlerinden faydalandık. 300'ten daha fazla indol türevini ve 1280 tane FDA onayı almış ilacı hücre bazlı tetkiklerle analiz ettik. Bu analizlerin sonucunda, hücresel toksikliği olmayan ve orta nanomolar seviyede IC50 değerine sahip bir çok molekül tanımladık. Daha sonraki çalışmalarla, bu inhibitörlerin tersinir olduğunu gösterdik. İnhibasyon mekanızmasını daha iyi anlayabilmek için bilgisayar yardımıyla vi yanaştırma modeli geliştirdik ve inhibitörlerin IL1 receptörüne tahmini bağlanma bölgesi üzerinde çeşitli mutasyonlarla analizler yaptık. Analizlerimiz, küçük molekül inhibitörlerimizin muhtemelen IL1R sinyalizasyonu yolağında başka bir protein ya da proteinleri inhibe ettiğini göstermiştir. Gelecek çalışmalarda, bu protein ya da proteinlerin neler olduğunu karakterize etmeye çalışacağız. Ayrıca, hayvan modelleri de küçük molekül inhibitörlerimizin biyolojik analizleri için kullanılacaktır.

Autoinflammatory diseases occur when the body's innate immune system is abnormally activated. There are more than eighty types of autoinflammatory diseases which affect >5% of the population in Western countries. Elevated levels of Interleukin-1 (IL1) cytokines, especially IL1β and IL1α, are observed in many types of autoinflammatory diseases including Behcet's Disease and Familial Mediterranean Fever (FMF). IL1β binds Interleukin-1 Receptor (IL1R) and initiates NLRP3 (cryopyrin) inflammasome activation. Aberrant levels of IL1R signaling and inflammasome activation promote autoinflammatory diseases. With such a critical role there are several treatment options to reduce inflammasome activation including: caspase-1 inhibitors which are not FDA proved, IL1R antagonists and neutralizing α-IL1β antibodies. Because the known therapies are protein-based, they are costly and require daily injections. However there are no identified IL1R small molecule inhibitors which can be less costly and overcome the injection barriers. Therefore the goal of this thesis was to identify and characterize novel small molecule inflammasome inhibitors. For this, we utilized in silico modeling in combination with drug repurposing to develop small molecule inhibitors which target IL1R signaling pathway. We screened >300 indole derivatives, and 1280 FDA-approved drugs from the Prestwick Library in a cell-based assay. From this we identified several compounds with mid-nanomolar IC50 and no obvious cellular toxicity. Further studies suggest that these are reversible inhibitors. To better understand the mechanism of inhibition, we developed a docking model to identify possible binding sites of small molecules and performed mutagenesis analysis with the predicted binding pocket. Our experimental data suggests that our small molecule inhibitors possibly inhibit some other protein/s in the down signaling mechanism of in the IL1R pathway. For future studies, we are going to try to iv characterize this/these protein/s. In future experiments, animal models will be utilized for the biological analysis of our small molecule inhibitors.