Investigation of the intracellular loop 3 and allosteric mechanisms of β2-adrenergic among G-protein coupled receptors

Abstract

G-protein kenetli reseptörler insan genomunda 700'den fazla gen ile kodlanmaktadır. G-protein kenetli reseptörler ortak 7 transmembran yapısı ve değişken hücre içi ve hücre dışı düğümlerden oluşur. Transmembran reseptörleri olarak, hücrelerin hücre dışı ile iletişimlerini sağladıkları birer kapı ve kapıcı görevi sürdürmektedirler. Bu nedenle G-protein kenetli reseptörlerin işleyiş mekanizmaları güncel bilimsel sorulardan biri olarak önemli bir yer kapsamaktadır. Bu çalışmada G-protein kenetli reseptörlerin takdimi, insan β2-adrenergic proteinin karakteristikleri ve β-adrenergic reseptörlerin doğal ligandının bağlanma afinitesi araştırılmıştır. Literatürde genellikle β2-Ar'ın üçüncü hücreiçi ilmiği yapılan çalışmalarda yoksayılmaktadır. Çalışmanın ilk ayağı olarak β2-Ar üçüncü hücreiçi ilmiğinin proteinin inaktif halinden aktif halindeki konformasyona geçişi için gerekli olan enerji hesaplanmıştır. ICL3 bölgesinin aktif olmayan konformasyondan aktif konformasyonuna getirilebilmesi için gereken enerji 1629 kJ/mol olarak hesaplanmış, G-protein bağlanmasından açığa çıkan enerjinin -1455 kJ/mol olduğu farklı bir moleküler simulasyon hesabı ile desteklendiği gözlemlenmiştir. Çalışmanın ikinci ayağı olarak rezidüler arası iletişim ağları korelasyon matrislerinin analizi üzerinden tespit edilmesi hedeflenmiştir. Allosteri analizinde β3-Ar proteinin lipid hucre zari içine gömülü halde simüle edildiği iki farklı gidişiz kullanılmıştır.Gidişizlerden bir tanesi 1 μs boyunca monomeric ve herhangi bir kısıtın bulunmadığı simülasyonun sonucunda, bir tanesi ise 500 ns boyunca reseptörün aktif durumundaki yapısı tanımlanmış olan Asp113 ve Ser207 arasında 8 Å kısıt uygulanarak ligand bağlanmasının mimic edildiği simülasyonun sonucunda elde edilmiştir. 1 μs simülasyon sonucunda, birinci hücreiçi ilmiğinin (ICL1), transmembrane 6'nın hücreiçi sonlanma bölgesiyle (Cys265, Lys267) iletişim halinde olduğu gözlemlenmiştir. Birinci hücreiçi ilmiğinde yer alan Thr66'nın proteinin lipid membrane içerisindeki stabilizasyonunda rol oynadığı ve Tyr123 (TM3) ve Ile154 (TM4) üzerinden işleyişini gerçekleştirdiği gözlemlenmiştir. Birinci hücredışı ilmiğinde yer alan Trp99'un ikinci hücre dışı düğümünde yer alan Cys191 ve transmembrane 5'in membrane bölgesinde bulunan Ile214 ile yine birinci hücredışı ilmiğinde yer alan Phe101'in transmembrane 6'nın hücredışı bölgesi ile transmembran 5'in hücreiçi kısmıyla korele olduğu gözlemlenmiştir. 500 ns süren ve ligand bağlanmasını mimic eden simülasyonda ise birinci hücredışı ilmiğinde yer alan Met98'in Phe61 (ICL1), Thr68 (transmembrane 2'nin hücreiçi sonu) ve Leu339 (sitoplazmik düğüm) ile iletişim halinde olduğu gözlemlenmiştir. Yine birinci hücre dışı ilmiğinde bulunan Gly102'nin ise Glu82 (TM2 membran bölgesi), Arg131 (TM3 hücreiçi sonu), Ser143 (ikinci hücre içi ilmiği) ve Phe223 (TM5 hücreiçi sonu) ile bir iletişim ağı kurduğu gözlemlenmiştir. Üçüncü iletişim ağı ise transmembrane 3'te bulunan Ile 135 ile Ala92 (TM hücredışı bölgesi), Val160, Leu163 (TM4 membran bölgesi) ve Ala202 (TM5 membran bölgesi) arasında olduğu gözlemlenmiştir. Elde edilen bulgular birinci hücreiçi ilmiğinin (ICL1) ligand tanıma sinyalleri ile ilintili iken ECL1'in protein stabilizasyonu ve hücre içi effektörlerin tanımlanmasında rol oynayabiliyor olacağını göstermektedir. Son olarak, epinephrine'in β-adrenergic reseptörleri arasında seçiciliği β2 > β3 > β1 olarak gözlemlenmiştir.

G-protein coupled receptors are encoded over 700 genes in human genome. They share a common seven transmembrane domain and differing intracellular and extracellular loops. As transmembrane domains, they function as gate-keepers of intercommunication of cells. Thus, their functioning mechanisms are one of most unique ongoing research area. In this study after the introduction of GPCR families, human β2-adrenergic receptor and endogenous ligand epinephrine are investigated. First of all, usually omitted part of β2-Ar intracellular loop 3 and its unbinding energy from inactive to the active state is estimated. Secondly, intracommunications between residues are investigated via correlation matrices. In allostery analysis, two trajectories of β2-Ar embedded in lipid membrane are analyzed. One of the trajectories is gathered from 1 μs molecular dynamics simulation and second trajectory is gathered from 500 ns molecular dynamics simulation where the ligand binding pocket is restrained to 8 Å in order to mimic ligand binding. Specifically for β2Ar, experimental measurements show that the distance range of 8Å - 10Å between Asp113 and Ser207 is sufficient for receptor activation.In 1 μs simulation, it is observed that ICL1 (residues 64 to 66) is in communication with intracellular end of TM6 (Cys265, Lys267). Thr66 of ICL1 is important in protein stabilization in lipid membrane and functions through Tyr123 (TM3) and Ile154 (TM4). Trp99 of ECL1 is correlated to ECL2 (Cys191) and membrane region of TM5 (Ile 214). Phe101 of ECL1 is correlated extra cellular end of TM6 and intracellular end of TM5.In 500 ns simulation, Met98 of ECL1 is correlated to intracellular end of TM1 (Arg53), ICL1 (Phe61), intracellular end of TM2 (Thr68) and cytoplasmic tail (Leu339). Gly102 of ECL1 is correlated to membrane region of TM2 (Glu82), intracellular end of TM3 (Arg131), ICL2 (Ser143) and intracellular end of TM5 (Phe223). Ile135 of TM3 at intracellular region is correlated to extracellular part of TM2 (Ala92), membrane region of TM4 (Val160, Leu163) and membrane region of TM5 (Ala202). These finding imply that ICL1 may be responsible for ligand recognition signals whereas ECL1 is responsible for protein stabilization and recognition of intracellular effectors.In estimation of required energy for unbinding of intracellular loop 3 is found as 1629 kJ/mol and confirmed with G-protein coupling energy to β2-Ar with the work of -1455 kJ/mol.Finally, the endogenous ligand epinephrine of β-adrenoceptors is studied in order to estimate critical differences between β1, β2, β3 ligand binding pockets for epinephrine and their selectivity.