Functional and structural characterization of androgen receptor variant 7(ARV7) in prostate cancer

Abstract

Androjen reseptörü (AR) prostat kanserinin tüm aşamalarında önemlidir. İlginç bir şekilde, ileri seviye prostat kanseri hastalarında androjen reseptörünün alternative splicing (alternatif kırpılma) ile androjen reseptör varyantlarının (ARVs) ortaya çıktığı gösterilmiştir. Ligand bağlama bölümü (LBD) bulunmayan bu sürekli aktif varyantları doğal olarak klinikte onaylanmış tüm androjen reseptörü antagonistlerine dirençlidir. ARV7 aktivasyon mekanizmasının anlaşılması daha geç evre prostat kanseri hastalarının tedavisi için büyük önem taşımaktadır.Ligand bağlanması ile birlikte, androjen reseptörü N-terminal bölümü (NTD) ve ligand bağlanma bölgesini molekül içi etkileşimi meydana getirecek şekilde hızlı bir yapısal değişikliğe uğramaktadır. Daha sonra AR hücre çekirdeğine geçerek burada birbirlerine bağlanır ve dimer yapılar oluştururlar. Ligand bağlanma bölgesi eksikliği göz önünde bulundurulduğunda androjen reseptörü varyantlarının benzer bir şekilde homodimerize olup olmadığı ya da androjen reseptörü ile heterodimerize olup olmadığı bilinmemektedir. Bu proje hücre biyolojisi ve biyofizik kullanarak androjen reseptörü varyantlarının olası homodimerizasyon ya da androjen reseptörü ile heterodimerizasyonunu açıklığa kavuşturmayı amaçladık.Sıkça rastlanan AR varyasyonu olan ARV7 kullanarak LNCaP hücrelerinde Tetrasiklin-indüklenebilir ARV7 modeli ile ARV7'nin hücre döngüsü ilerlemesi ve AR'nin sebep olduğu gen transkripsiyonunu üzerine etkisini inceledik. Şaşırtıcı bir şekilde, LNCaP hücre hattının dilüsyon serileri kullanılarak elde edilen tek hücre kolonilerinde ARV7 ekspresyonunun belirgin bir şekilde erken hücre yaşlanmasına neden olduğunu ve yaşlanma derecesinin ARV7 sentezlenmesine bağlı olduğunu bulduk. Ayrıca bu değişimin androjen reseptörü seviyesinden bağımsız olduğunu ve p53 yolağının aktivasyonu aracılığı ile gerçekleştiğini gözlemledik. Bu fenotipi aynı zamanda androjene duyarlı farklı prostat kanseri hücre hatlarında da gözlemledik. Sonuçlarımız ARV7'nin sürekli aktifliğinin androjen reseptörünün varlığına bağlı olduğunu ve androjene duyarlı hücrelerin AR bağımlı büyümeden ARV7 bağımlı büyümeye değişime tolere etmediğini göstermiştir. Ayrıca klinikte gözlemlenen duruma benzer olarak ARV7 expresyonuna dirençli olan birkaç farklı tek hücre kolonileri tespit ettik.Aynı zamanda canlı hücre görüntüleme Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi tekniğini kullanarak ARV7 ve AR arasında olduğu tahmin edilen moleküller arası etkileşimlerini çalıştık. Canlı hücrelerdeki FRET sinyalini hesaplayan ve hücreleri takip eden özel analiz yazılımı kullanılarak, androjen reseptörünün ligandı ile uyarılması sonucu ortaya çıkan etkileşimleri zamansal bir şekilde gözlemledik. Bu yöntemi kullanılarak elde ettiğimiz sonuçlar androjen reseptörü ve ARV7'nin etkileşimde olduğunu göstermiştir. Kullandığımız deneysel tasarım androjen uyarımı ile oluşan etkileşimleri, zaman mekânsal bir şekilde tespit etmeyi ve farklı yapısal değişiklikleri gözlemlemeyi sağlamıştır.

The androgen receptor (AR) is critical at all stages of prostate cancer. Interestingly, Androgen Receptor Variants (ARVs) have been shown to occur in late-stage prostate cancer patients by alternative splicing of the AR. Lacking a ligand binding domain (LBD) these constitutive active variants are intrinsically resistant to all clinically approved AR antagonists. Understanding the mechanism of ARV7 activation is critical to better treating late-stage prostate cancer patients.Upon ligand binding, the AR rapidly undergoes an allosteric modification that allows the N terminal domain and LBD to form an N-C intramolecular interaction. Following nuclear localization, the AR then forms homodimers via intermolecular interactions. Given that ARV7 lack a LBD, it is unclear if the variants undergo a similar homodimerization or they in fact heterodimerize with the ARfull-length. To clarify this, the project aims to study ARV7 interactions using both cell biology and biophysics.Utilizing a commonly observed variant (ARV7) and using a Tet-inducible ARV7 model in LNCaP cells we were able to study the impact of ARV7 on cell cycle progression and AR signaling. Surprisingly, in single cell clones we found that overexpression of ARV7 causes marked cellular senescence and the degree of senescence was dependent on the expression of ARV7. This was independent of ARfull-length and was mediated by an activation of the p53 pathway. This phenotype was also observed in several androgen responsive prostate cancer cell lines. Our results indicate that constitutive activity of ARV7 was dependent on the presence of androgen receptor and a shift from androgen receptor mediated growth to ARV7 mediated growth is not tolerated in AR dependent cells. Interestingly, we were able to identify several clones that were resistant to ARV7 expression mimicking what is clinically observed. We also studied the predicted inter- or intramolecular interaction between ARV7 and ARfull-length with live cell imaging FRET microscopy. Using custom analysis software that can track and quantify the FRET signal in living cells we observed inter- and intramolecular interactions of ARfull-length upon stimulation with its ligand in temporal manner. Using this methodology our results suggest that ARfull-length and ARV7 form a C-C interaction. The experimental design we used enabled spatiotemporal identification of the interactions and revealed different conformational changes happening throughout androgen stimulation.