Characterization of androgen receptor variant 7 dimerization in prostate cancer

Abstract

Prostat kanseri, yaşam süresi boyunca yaklaşık her yedi erkekten birini etkileyen oldukça yaygın bir hastalıktır. Bu kanser türü genelde ameliyat ve radyoterapi ile tedavi edilebilirken, geç evredeki hastalar için, reküran veya metastatik prostat kanseri türlerine genel olarak androjen deprivasyon terapisi uygulanmaktadır. Bu tedavi yönteminin ilk aşamalarda etkisi görülürken, sonraki aşamalarda kanser tedaviye direnç kazanıp, kastrasyona dirençli prostat kanserine (KDPK) dönüşmektedir. Yakın zamanda yapılan çalışmalara göre, androjen reseptörü varyantları, ARv7 ve ARv567es dahil olmak üzere, androjen yokluğunda AR sinyal yolağını uyararak ve KDPK oluşumuna katkıda bulunmaktadır. Bu varyantlar transkripsiyonu başlatmak için androjene ihtiyaç duymazken, bu nedenle hepsi klinik açıdan onaylanmış bütün terapi yöntemlerine direnç göstermektedir.AR varyantları KDPK ile ilişkilendirilirken, bu varyantların aktivasyon ve dimerizasyon için gerekli olan ana bir bölgeden yoksun olmasından dolayı, transkripsiyonun nasıl başladığı halen bilinmemektedir. Bu nedenle, varyant dimerizasyonunun daha iyi anlaşılabilmesi için, AR varyantlarından sıklıkla karşılaşılan ARv7 varyantının dimerizasyon yapıp yapmadığını test etmek için, photobleaching sonrası floresan kurtarma floresan rezonans enerji transferi (FRET)-tabanlı bir metot geliştirdik.FRET ölçümlerini, tek bir hücre çekirdeğini izleyen ve FRET yoğunluğunu kaydeden özel bir metodoloji ile yaptık. ARv7'nin flAR ile heterodimer yapmayı tercih ettiğini, ARv7/ARv7 homodimerizasyonu olmadığını gösterdik. ARv7 ve flAR arasındaki göreceli afiniteyi ölçmek için, FRET deneylerini flAR ve ARv7 anlatımının ayarlanabilir olduğu bir sistem ile uyguladık. Bu modelle, flAR homodimerizasyon kaybını artan konsantrasyonlardaki işaretlenmemiş flAR veya ARv7 arasındaki rekabet ile gözlemledik. flAR ile ARv7 arasındaki afinitenin, flAR homodimeri ile aynı olduğunu gösterdik. Gözlemlenen varyant dimerizasyonunun sadece ARv7'ye özel olup olmadığını test etmek için, ARv567es ile flAR arasında FRET uyguladık. ARv7'de olduğu gibi, ARv567es'in de flAR ile heterodimer oluşturduğunu gözlemlerken, ARv567es homodimerine rastlamadık.ARv7/flAR heterodimerinin DNA'ya bağlı miktarını daha iyi belirlemek için, photobleaching sonrası floresan geri kazanımı (FRAP) deneylerini gerçekleştirdik. ARv7'nin, flAR heterodimerizasyonuna bağlı olmayan, DNA üzerindeki bulunma süresinin çok kısa olduğunu bulduk. Bu bulgulara göre, ARv7'nin DNA ile uzun süreli etkileşimlerde bulunmadığını gösterdik. Aslına bakılırsa, bu varyantın DNA üzerinde bulunma süresi DNA'ya bağlanamayan mutant flAR ile benzerlik göstermektedir. ARv567es'in geri kazanım süresinin de DNA'ya bağlanamayan flAR mutantı ile benzerlik gösterdiğini düşünürsek, bu durumun sadece ARv7'ye özgü olmadığını söyleyebiliriz. Daha önce belirttiğimiz 'tunable' (kontrol edilebilir) sistemi kullanarak, işaretlenmemiş proteinin DNA'da bulunma miktarının, işaretlenmemiş protein ile birlikte ifadesi sonucunda önemli ölçüde değişmediğini gözlemledik.Sonuç olarak, ARv7 ve ARv567es flAR'a bağlanarak heterodimer oluşturmaktadır. Bu varyantlar, DNA üzerinde sabit bağlantılar oluşturmazken DNA'ya bağlanma süreleri kısadır. Potansiyel terapötik hedef olan AR varyant heterodimerlerinin KDPK'deki fonksiyonlarının daha iyi anlaşılması için, ilave çalışmaların yapılması gerekmektedir.

Prostate cancer is an extremely common disease that affects an estimated 1 out of 7 men in their lifetime. While the cancer can often be treated through surgery or radiotherapy, those patients with late-stage, recurrent or metastatic forms of prostate cancer are often given androgen deprivation therapy. While this treatment is initially effective the cancer almost always develops resistance, and progresses to castrate resistant prostate cancer (CRPC). Recent studies have proposed that androgen receptor variants, including ARv7 and ARv567es, can cause AR signaling in the absence of androgen and may drive CRPC. As these variants do not need androgen to initiate transcription, they therefore are intrinsically resistant to all clinical approved therapeutics. While AR variants correlate with CRPC, it is unclear how they initiate transcription as they are missing a key domain involved in activation and dimerization. Therefore, to better understand the mechanism of variant dimerization we developed an acceptor photobleaching FRET based methodology to test if the most commonly observed variant, ARv7, can form dimers. AbFRET measurements were analyzed with a custom methodology designed to track single nuclei and record the FRET intensities. We demonstrated that ARv7 preferentially formed heterodimers with flAR, with no ARv7/ARv7 homodimerization being detected. To quantify the relative affinity of the ARv7 with flAR, we conducted abFRET with a `tunable` system that can vary the flAR and ARv7 expression. With this model, we monitored the loss of flAR homodimerization due to competition with increasing concentrations of unlabeled flAR or ARv7. We demonstrated that ARv7 interacts with flAR with a same affinity as flAR. To test if the observed variant dimerization was specific to only ARv7, we also conducted abFRET with ARv567es. Similar to ARv7, we could readily observe flAR/ARv567es heterodimers but no ARv567es homodimers. To better understand the bound DNA occupancy of the ARv7/flAR heterodimer, we performed fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments. We found that the ARv7 residence time on DNA was markedly shorter than flAR regardless of heterodimerization. These results suggest that ARv7 does not form long-term interactions with DNA. In fact, the occupancy time of the variant was similar to a mutant flAR that cannot bind to DNA. This was not specific to only ARv7, as the recovery time of ARv567es was similar to DNA binding mutant flAR. Using the previously described `tunable` system we found that co-expression of unlabeled protein did not dramatically affect DNA occupancy. In conclusion, ARv7 and ARv567es interact with flAR to form heterodimers. These variants do not form stably bound fractions on DNA and have much shorter occupancy. Further studies are needed to better understand the function of AR variant heterodimers in CRPC as a potential therapeutic target.