The role of histone H3 lysine 36 methylation in reprogramming of fibroblasts and on induced pluripotent stem cell generation

Abstract

Embriyonik kök hücreler (EKH) vücutta bulunan bütün somatik hücreleri oluşturabilmekapasitesine sahiptir. OCT4, SOX2, KLF4 ve cMYC (OSKM) transkripsiyonfaktörlerinin farklılaşmış hücrelere sunulması, yeniden programlamayı uyarıp EKHbenzeriuyarılmış plüripotent kök (uPKH) hücrelerin oluşmasını sağlamaktadır.Yeniden programlama, birden çok aşamalı bir süreçtir ve her aşamasında belirlimoleküler değişikliklerin gerçekleşmesi gerekmektedir. Bununla birlikte, kromatindüzenleyicilerinin, somatik hücrelerin gen ifadeleri üzerindeki etkileri ve yenidenprogramlamayı nasıl etkilediği konusunda birçok cevaplanmamış soru bulunmaktadır.SETD2, aktif transkripsiyon ile ilişkilendirilen Histone H3 lizin 36 (H3K36) kalıntısınıntri-metilasyonundan sorumlu olduğu bilinen tek kromatin düzenleyicidir. H3K36metilasyonunun yeniden programlama üzerindeki etkisi halen bilinmemektedir. Busebeple SETD2'nin insan fibroblast hücrelerinin yeniden programlanması üzerindekirolünü, shRNA-tabanlı gen susturulması ya da gRNA-tabanlı gen çıkarılmasıstratejileri ile inceledik. Buna ek olarak, H3K36 metilasyonu kaybının gen ifadesi ağınınasıl etkilediğini anlamak amacı ile, OSKM-sunumu öncesi ve sonrası elde edilenSETD2 ifadesi azaltılmış hücrelere RNA dizileme analizi uyguladık.Elde ettiğimiz sonuçlara göre, SETD2 ifadesin baskılanması, genel H3K36me3ifadesinde azalmaya yol açmakta ve bu soytür, fibroblast hücrelerinin OSKM-tabanlıyeniden programlaması arttırmaktadır. Ek olarak, SETD2 ifadesindeki baskılanma,OS-tabanlı yeniden programlama sürecinde KLF4 ve cMYC yerine geçmek içinyeterlidir. SETD2 ifadesindeki azalış, yeniden programlamanın erken evrelerindeetkili iken, RNA dizileme ile de anlaşıldığı üzere, bu durum somatik gen ifadelerininazalmasına yol açmaktadır. Bu soytür, H3K36 metilasyonunu baskın olarakengelleyen histone H3 mutantının aşırı ifadesi sonucunda da görülmektedir. Busebeple, SETD2'nin baskılanması sonucunda görülen H3K36me3 aktif işaretindekiazalışın, OSKM faktörlerinin fibroblast-özgü ifadeler üzerindeki baskılayıcı etkisinekatkıda bulunduğunu öne sürmekteyiz.Elde ettiğimiz sonuçlar göz önüne alındığında, SETD2'nin yeniden programlama içinbir engel olduğu ve ifadesindeki azalışın somatik gen ifadelerini baskılaması yolu ileyeniden programlamayı olumlu etkilediği görülmektedir.

Embryonic stem cells (ESCs) have the capacity to form all types of somatic cells inthe body. Introduction of four transcription factors OCT4, SOX2, KLF4 and cMYC(OSKM) into somatic cells induces reprogramming to generate ESC-like cells.Reprogramming is a step-wise process which requires several molecular changes.One of these is the remodeling of global chromatin landscape of somatic cells to gainpluripotency. However, there remain many unanswered questions regarding theinfluence of chromatin regulators on the gene expression network of somatic cells andhow they affect reprogramming.SETD2 is the only chromatin modifier responsible for generating the H3 Lysine 36(H3K36) trimethylation, a histone mark that is associated with active transcription. Therole of H3K36 methylation in reprogramming remains unknown. Therefore, weinvestigated the role of SETD2 in reprogramming via shRNA-mediated knock-downor gRNA-mediated knock-out strategies in human fibroblasts. We also performedRNA sequencing on SETD2-depleted cells before and after OSKM-induction tounderstand how loss of H3K36 methylation affects gene expression networks.Our results demonstrate that, global H3K36me3 decreases upon SETD2 depletionand this phenotype enhances OSKM-mediated reprogramming of fibroblasts.Additionally, SETD2 depletion is sufficient to replace KLF4 and cMYC in OS-mediatedreprogramming. Downregulation of SETD2 is effective in the early stages ofreprogramming and leads to a decrease in somatic specific gene expression levels.This phenotype is also observed upon overexpression of a histone H3 mutant thatdominantly blocks H3K36 methylation. We suggest that reduction of H3K36me3active marks upon SETD2 depletion contributes to OSKM-mediated suppression offibroblast specific genes.Taken together these results indicate that SETD2 is a roadblock for reprogrammingand reduction of its expression has a positive effect on reprogramming throughsuppression of somatic specific genes.