Hücre soylarını oluşturmada kullanılan plazmid profilinin belirlenmesi

Abstract

Arıkan, M. Hücre Soylarını Oluşturmada Kullanılan Plazmid Profilinin Belirlenmesi.İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Genetik ABD. Yüksek Lisans Tezi.İstanbul. 2012.Amaç. Kontrollü deneysel modellerin oluşturulmasında hücre soyları in vitro çalışmalariçin önemli materyallerdir. Spesifik genotipik özelliklere sahip hücre soylarınınoluşturulması için kullanılan en yaygın yol DNA virüsleri veya antijenleridir.İmmortalizasyon işleminde kullanılan vektör DNA dizileri, genomik DNA'ya entegreolur. Bu çalışmada, söz konusu vektörlere ait DNA parçalarının binlerce pasaj sonrasıdurumları, K562 ve 293T hücre soylarında sorgulanmıştır.Yöntem. K562 ve 293T hücre soylarındaki entegre plazmid DNA dizileri, pLVTHMlentiviral vektörüne özgü örtüşen problar ile hedefli dizi yakalama yöntemi (sequencecapture array) kullanılarak genomik DNA'dan ayrılmıştır. Daha sonra, alınan DNAparçaları yeni nesil dizileme teknolojisi kullanılarak dizilenmiştir. Dizileme sonuçlarıbiyoinformatik metotlarla analiz edilmiştir.Bulgular. Dizileme sonucu immortalizasyonda kullanılan DNA vektör dizileri ileeşleşen 22980 DNA dizisi elde edilmiştir. Bu dizilerin iki hücre soyunda benzer şekildeneomisin direnç geni, SV40 T antijeni gibi temel DNA vektör bileşenleri ile eşleştiğitespit edilmiştir. Ayrıca, SV-40'ın iki hücre soyunda da 3p24.3 kromozomalbölgesindeki TBC1D5 genine entegre olduğu belirlenmiştir.Sonuç. K562 ve 293T hücre soyları için immortalizasyonda kullanılan vektör dizileribelirlenmiş ve SV-40 T antijenin bu hücrelerdeki integrasyon bölgesi tespit edilmiştir.Farklı hücre soylarında standart plazmidlerin kullanıldığı ve SV40 plasmidlerinin aynıbölgede istikrarlı hale geldiği tespit edilmiştir. Bu durumda plazmidlerin, genomaintegrasyon tercihinin konak hücrenin karakteristik özellikleri ve genomun topografikyapısı da rol alabilir.Anahtar Kelimeler: Plazmid DNA, immortalizasyon, yeni nesil dizileme, integrasyon,hücre soyu

Arıkan, M. Determination of plasmid profile used in cell line immortalization. IstanbulUniversity, Institute of Health Science, Genetics Department. MSc. Thesis. Istanbul.2006.Aim. One of the ways to create cell lines is infecting the cells with DNA tumor viruses.The DNA vector sequences that used for immortalization process are found to beintegrated in genomic DNA. At this study, the conditions of these DNA segments afterthousands of passages in K562 and 293T cell lines were investigated.Methods. The integrated plasmid DNA sequences in K562 and 293T cell lines werecaptured with overlapping probes covering pLVTHM lentiviral vector sequence usingsequence capture array. Then, the captured fragments were sequenced using nextgeneration sequencing technology and results were analyzed with bioinformaticmethods.Results. In the K562 and 293T cells, 22980 fragments matching viral DNA sequencesused for immortalization of the cell line were obtained. It has been determined that thesesequences similarly match with basic DNA vector elements, such as Neomycinresistance gene and SV40 Large T Antigen, in both two cell lines. Also, SV-40 wasfound to be integrated in TBC1D5 gene which is located at 3p24.3 chromosomal regionin both cell lines.Conclusions. Here, the profile of the vectors used in immortalization of the K562 and293T cell lines and the integration site of the SV-40 at these cell lines were determined.It was found that certain plasmids are used for immortalization of different cell linesand SV40 has stabilized in the same genomic site. It can be said that genomicintegration preferences of the plasmids depend on not only cell characteristics but alsogenomic structure of the host cells.Key Words: Plasmid DNA, immortalization, next generation sequencing, integration,cell line