Doğu Akdeniz bölgesi turunçgillerinde zararlı tristeza virüs hastalığının tanınması, aratılması, özellikleri ve serolojik yöntemlerle (elisa ve SDS-immunodiffision testleri) saptanması

Abstract

157 ÖZET San 50 yılda turunç anacı üzerinde 40 milyon dan fazla turunçgil ağacının yok olmasına neden olmuş olan tristeza virüs hastalığı, ülkemizde özellikle Doğu Akdeniz Bölgesi için de ayrı bir öneme sahiptir, çünkü, ülkemizde turunçgil yetiştiriciliğinin yoğunlaşmış bulunduğu Doğu Akdeniz Bölgesinde yetiştiricilik, hastalığa son derece duyarlı olan turunç anacı üzerinde yapılmaktadır. Buna ek olarak bölgede infeksiyon kaynağı alabilecek simptom gösteren veya göstermeyen, simptomsuz hasta ağaçlar saptanmıştır. Yaprak bitleri ile taşman hastalığın vektörlerinden olan A.gossypli, A.craccivora ve T.aurantii bölgemiz turunçgillerinde belirlenmiştir. İşte turunç anacının yaygın kullanılması, infeksiyon kaynağı olabilecek hasta ağaçların ve vektörlerinden bazılarının bulunması nedeniyle bölgede tristeza virüs hastalığı büyük bir tehlike oluşturmaktadır. Özellikle virüs hastalıklarından korunmada kültürel önlemler önemlidir. Ancak bundan önce hastalık etmeninin özelliklerinin bilinmesi, hızlı ve güvenilir tanılama yöntemlerinin kullanılması gereklidir. Bu çalışmada, bölgemiz için her an büyük bir potansiyel tehlike olarak karşımızda duran tristeza virüs hastalığının arıtılması ve antiserumunun elde edilmesi, etmenin part i küllerinin morfolojik özelliklerinin incelenmesi, bölgede var olan ırk veya ırklarının saptanması ve hastalığı tanılamada son derece duyarlı, hızlı ve güvenilir olan serolojik testlerden, özellikle ELISA testinin tanılama ve rutin çalışmalar ile surveylerde kullanılır hale getirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçlar doğrultusunda öncelikle simptomolojik olarak seçilen ağaçlar, indekslenmiş, ELISA testi ile testlenmis ve EM da incelenmişlerdir. Kesin hasta olduğu saptanan ağaçlar simptomolojik olarak incelendiğinde tristeza virüs hastalığı için belirlenmiş karakteristik simptomları taşıdıkları görülmüştür. Ancak söz konusu ağaçlar Florida ve Akdeniz ülkelerinde rapor edildiği gibi yavaş yavaş uzun sürede ölüme giden hastalık seyrini göstermektedirler. Böyle158 ağaçlar 20-30 yasında olmalarına karşın boyları ancak 1.5-2.5 m arasında değişmektedir. Doğu Akdeniz Bölgesinde, biolojik ve serolojik çalışmaların sonuçlarına dayanarak hafif ırkların söz konusu olduğu ortaya konmuştur. Ayrıca Mersin yöresinde mevcut Hafif ırk ile Kozan, Dörtyol ve Karataştaki ırk arasında da farklılık olduğu belirlenmiştir. Mersin yöresinde infekteli ağaçlar şiddetli bodurlaşma ve geriye ölüm ile hafif sararma simptomları gösterirlerken diğer bölgelerdeki ağaçların daha az şiddetli bodurlaşma ve geriye ölüm ile şiddetli sararma simptomları gösterdikleri görülmüştür. Hasta olduğu saptanan ağaçların yanındaki veya yakınındaki sağlıklı görünümlü bazı ağaçlarında ELISA testi ile testlenmeleri sonucu infekteli oldukları belirlenmiş ve bölgede doğal yayılmanın başladığı veya varolduğu, sonradan infektelenmiş bu ağaçların hastalığın simptomsuz taşıyıcıları oldukları ve bölge için asıl tehlikeyi oluşturdukları sonucuna varılmıştır. Kesin hasta olduğu belirlenen örneklerin kabuk ve meyve al bedol arından değişik uygulamalarla yarı arıtılan virüs sucros, CsCl CsaSQ* Density gradient santrifüjyonu ve kromotografik yöntemlerle tam arıtılmaya çalışılmıştır. Kabuk dokularından yarı arıtma çalışmalarında III. uygulamada en yüksek konsantrasyonda virüs elde edilirken, tam arıtma çalışmalarında CsCl density gradient santrifüjyonu hem meyve hemde kabuk dokuları için daha uygun alarak bulunmuştur. Meyve dokularından virüs, kabuk dokusuna göre daha kolay ve daha yüksek konsantrasyonda arıtılabilmiştir. Arıtma çalışmalarında elde edilen tam arıtılmış preparasyonlarda 260/280 oranı 1.13-1.31 arasında, konsantrasyon ise kabuk ve meyve dokularından olmak üzere 0.060-0.75 mg/ml düzeyinde gerçekleşmiştir. Meyve dokularından CsCl density gradient santrifüjyonu ile tam arıtılan preparasyona karşı tavşan kullanılarak antiserum elde edilmiştir. Elde edilen antiserumun titri, tüp presipitin testinde 1/64 olarak bulunmuştur. Bu antiserumdan ELISA testin de kullanılmak üzere ^-globulin saflaştırılmış ve kûnjugat hazırlanmış, karşılaştırmalı testlerde dışarıdan sağlanan antiserumlara benzer sonuçlar alınmıştır. Arıtma çalışmalarında ara aşamalarda, ELISA159 testi ile yapılan kontrollarda virüsün kaybedildiği aşamalar tesbit edilerek, virüs konsantrasyonun arttırılması sağlanmıştır. Bölgede, 4 yöreden seçilen 7 ayrı bahçeden çalışmaya alman simptomoloj ik olarak şüpheli 112 ağaçtan 71 inde EL ISA testi ile pozitif sonuçlar al inmiştir. Ayrıca ES ile yapılan çalışmalarda 10-12x1100-2044 nm boyutlarında ipliksi tristeza virüs partikülleri doğrudan yaprak ve kabuk dokuları ile arıtılmış preparasyonlarda saptanmış, indeksleme çalışmalarında meksika laym bitkilerinin yapraklarında hafif damar açılması ve gövde çukurlaşması simptomları ile çoğu örnekten pozitif sonuçlar alınmıştır. SDS-immunodiffision testi ile Immunoelektron mikroskop yöntemleri, koşullarımıza göre uygun bulunamamış, ancak ELISA testinin düşük titerli antiserumlar ile de uygulanabilir olduğu görülmüştür ELISA testi çalışmalarında kullanılacak en uygun dokunun kabuk dokusu, en uygun testleme zaraanmında, yılın her ayında pozitif sonuç alınmakla beraber, özellikle bahar ayları olduğu, survey çalışmalarında -20 'C de 6 aya kadar saklanan örneklerin testlemeler de kullanılabileceği ortaya konmuştur.

160 Identification, Purification, Serology (with ELISA and SDS- ianunodiffision tests), and Properties of Citrus Tristeza Virus (CT7) in East Jieditterranean Region of Turkey. SUMMARY Tristeza which destroyed more then 40 million citrus trees grafted on sour orange raotstocks within last 50 years in the world, carries a real importance in Eastern medditerranean region of Turkey since the citrus industry of Turkey is concentrated in this area and a very susceptible raDtstock sour orange is used very widely for propogation. In addition infected trees have also been determined to be carrier of the virus at the symptomless manner.This virus is carried by aphids, and some aphid vectors; Aphis gossypii, A.craccivora, T.aurantii were found in the region. Therefore, using of sour orange as a rootstock, existence of source of inoculum and some aphid vectors are the evidence for tristeza problems. The cultural methods are especially used to minimize virus diseases losses. Before application of these methods to reduce the losses, the property of pathogen must be well known. For this reason rapid and reliable technique shold be applied to identify of the pathogen. In this study, it was proposed; to purify the virus, to obtain the antiserum, to study the morphological characteristics of the virus particles, to determine the existance of any strains in the region and try to develop rapid, reliable and sensitive serological methods, like ELISA, to be used in identification and survey studies of CTV in our condition. For above purposes, trees were selected symptomatically, indexed, tested with ELISA and studied with EH. The re-examination of the infected trees determined by above methods showed typical siymptoms of tristeza virus, but the disease development in these trees was very gradual causing a death after a long period like those reported Florida and other Mediterranean countries, although these trees were 20-30 years old, their height were only 1,5-2.5 m.161 Biological and serological studies indicated the exi stance of mild strains in the region. In addition, a difference between the mild strain found in Mersin and the strain found in Kozan, Dörtyol and Karatas was determined, those trees in Mersin showed severe dwarfing and dieback and mild yellowing whereas those in other localities showed mild dwarfing, dieback, and severe yellowing. Realty looking trees around the infected trees were tested by ELISA and found to be infected by tristeza which indicated that natural spread of the disease might be started. The virus was partially purified from the bark and fruit albedo of the infected trees by various methods and then it was further purified by using sucrose, CsCl, CsaSQ* density gradient centrifugation and chromotografic methods. While the virus was obtained at highest concentration from the bark tissue in III. application of partial purification studies, the CsCl density gradient centrifugation in further purification was found more suitable for both bark and fruit tissues. When compared the virus was purified much easily with high concentration from the fruit tissues than bark tissues. In further purified preparations 260/280 ratio was 1.13 and 1.31 and the concentration was 0.080 and 0.750 mg/ml in bark and fruit tissues. Antiserum of the further purified virus throuhg CsCl density gradient centrifugation was obtained from the rabbit. The titer of the antiserum was found to be 1/64 in tube precipitation test, tf-globulin was purified from the obtained antiserum and conjugate was prepared. The comparative studies of conjugate and V-globulin gave very similar results with those of imported antiserum. In purification studies, controls were made by ELISA at each steps, to determine at what stage the virus was last, and then the concentration of the virus was increased. Out of 112 trees which were selected from 4 localities and 7 orchards according to their symptoms, 71 gave positive results by ELISA test. In addition, 10-12 X 1100-2044 nm thread-like virus particles was determined from directly from leaf and fruit tissues and purified preparation under EM. In indexing studies, most of the Mexican lime seedlings gave mild vein clearing and stem pitting. SDS-immunodiffision162 test and immunoelectron microscope methods were not found to be suitable for our conditions, however the use of ELISA with low titered antiserum was seemed possible. Although positive results were obtained from the materials that were collected from the orchards all year around, the spring months were the best for testing time for ELISA tests. Among the tissues, the bark tissue gave the best results for ELISA test. Samples taken in survey studies and fcept in - 20 *C for 6 months were found to be useable for testing.