Ailanthus altissima`da kadmiyum toleransı ve fitokelatin oluşumu

Abstract

V. ÖZET Ailanthus altissima'da. kadmiyum toleransı ve fitokelatin oluşumu Bu çalışmada bitkilerde Cd toksisitesi, Cd birikimi ve Cd toleransı ince lenmiş ve Cd toleransında rol oynayan fitokelatinlerin oluşumu sap tanmıştır. Araştırmamızın ilk bölümünde 5 farklı bitki türünde (A.altissima, P.abies, L.esculentum, Z.mays, V.radiaîa) Cd toksisitesi, Cd birikimi ve Cd toleransı belirlenmiştir. Su kültürlerindeki fidelere, 27 gün süreyle, değiştirilmiş Ingestad besi çözeltisi içinde 6 farklı Cd konsantrasyonu (10, 30, 50, 100, 200, 500 pM) uygulandı. Deney süresince, düzenli aralıklarla kök ve gövde uzunlukları ölçüldü, bitkilerin genel durumu ve görünümleri kaydedildi. Deney sonunda bitkiler hasat edildi, köklerin taze ve kuru ağırlıkları alındı ve kök örneklerindeki Cd miktarı AAS ile saptandı. Uygulanan Cd konsantrasyonu arttıkça kök ve gövde uzunlukları, aynı zamanda taze ve kuru ağırlıklar indir gendi, ancak köklerdeki Cd miktarında artış oldu. Yukarıdaki verilerle bitki lerin Cd toleransı belirlendi. Sonuçlara göre, A.altissima, P.abies, Z.mays, L.esculentum, V.radiata için tolerans sınırları sırasıyla 200, 100, 50, 30 ve 10 /iM olarak saptandı. Araştırmanın ikinci bölümünde A.altissima bitkisinde fitokelatin (PC) oluşumu incelendi. Su kültürlerindeki bitkilere 1 hafta süreyle letal dozun altında Cd (200 pM) uygulandı ve bitki kökleri ekstre edildi. Ekstredeki Cd-bağlayan proteinler kromatografik yöntemlerle saflaştırıldı (QAE-Sephadex A-25, Sephadex G-75) ve elde edilen fraksiyonlardaki Cd miktarı alevli AAS ile ölçüldü. Cd'un gerek küçük polipeptidlere ve gerekse büyük proteinlere bağlandığı belirlendi. Bu fraksiyonlar, 109Cd2+ bağlanma esasına dayanan, nativ poliakrîlamid jel elektroforez (PAGE) ve otoradyogra- fi yöntemleriyle analiz edildi. 68Otoradyografik incelemelerde, gerek düşük gerekse yüksek moleküler ağırlıklı proteinlerin 109Cd2+ ile bileşik oluşturduğu saptandı. Verilere göre, düşük moleküler ağırlıklı bu bileşiklerin (Y-Glu-Cys)n-Gly, n=2-6, yapısındaki fitokelatinler olduğu düşünülmektedir. Saptanan fîtokelatinlerin ve diğer Cd-bağlayan proteinlerin (Cd-BP) mo leküler ağırlıklarını bulabilmek amacıyla SDS-PAGE uygulandı. PC değerleri 10.5-26 kDa arasında değişim gösterdi ve Cd-BP'ler > 50 kDA ola rak belirlendi. Cd içeren saflaştırılmış fraksiyonlardaki total protein miktarı da spektrofotometre ile ayrıca ölçüldü. A.alîissima ile benzer koşullar altında yürütülen bir diğer deney serisi de kum kültürlerinde yapıldı. Cd-bağlayan proteinlerin oluşumunda zamanın et kisini inceleyebilmek için Cd uygulanan fidelerin kökleri 1 hafta boyunca hergün ekstre edildi. Ancak, kum kültürlerinde Cd alımının yavaş olması ne deniyle otoradyografi filminde sadece çok zayıf sinyaller elde edilebildi. Sonuç olarak A.altissima'da Cd-tolerans mekanizmasında rol oynayan fi- tokelatinleri saptamış olduk. Literatürde bu bitkiyle ilgili benzer nitelikte her hangi bir çalışmaya ise rastlamadık, özellikle kentsel ve endüstriyel kirliliğin bulunduğu bölgelerde dağılımı dikkat çeken A.altissima'mn, araştırmamızda elde edilen veriler de gözönüne alındığında, çevre kirlenmesi ile ilgili sorun ların çözümünde önemli yer tutacağı kanısındayız. 69

SUMMARY Cadmium tolerance and phytochelatin production in Ailanthus altissima In this investigation, Cd toxicity, Cd accumulation and Cd-tolerance in plants has been observed, and then phytochelatin production which plays role on Cd-tolerance been detected. In the first part of the research, Cd toxicity, Cd accumulation Cd toleran ce of 5 different plant species (A.altissima, P.abies, L.esculentum Z.mays, V.radiata) were monitored. Hydroponic cultures of the seedlings were expo sed to 6 different Cd concentrations (10, 30, 50, 100, 200, 500 piM) in a modi fied Ingestad solution for 27 days. Root lengths and shoot heights of plants were measured and general conditions and appearences were registered regu larly during the experimental period. At the end of the experiment, fresh and dry weights of roots were surveyed and the Cd content of root samples deter mined using AAS. Root and shoot lengths, as well as fresh and dry weights were reduced, but Cd content of the roots increased with the increasing con centrations of Cd treatment. By the using of above mentioned datas, Cd tolerance of plants were de tected. According to these results, Cd-tolerance limits for A.altissima, P.abies, L.esculentum, Z.mays, V. radiata are found 200, 100, 50, 30, and 10 /«M, respectively. As a second part of investigation, phytochelatin (PC) production in A.altissima plant was observed. Plants were treated with sublethal dose of Cd (200 /<M) in hydroponic cultures for a week and those plant roots were ext racted. Cd-binding proteins in the extract was purified by chromatographic techniques (QAE-Sephadex A-25, Sephadex G-75) and the Cd content of the eluted fractions was determined using flame AAS. Cd was apparently bound to both smaller polypeptides and to larger proteins. 70These fractions were analyzed with a 109Cd2+ binding assay using non- denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and autoradiography. Due to the autoradiographic observations both low and high molecular weight proteins which make complex with 109Cd2+ were detected. We estimated that the data indicated low molecular weight compounds, belongs to phytochela- tins of the type (y -Glu-Cys)n-Gly, where n=2-6. Then, SDS-PAGE were applied to detect the molecular weights of these phytochelatins and other Cd-binding proteins. PC values fluctuated between 10.5 - 26 kDa and Cd-BPs were found as > 50 kDa. Total protein amounts of the Cd-containing purified fractions were also determined by using spectrophotometer. Other serial of investigation carried out in sand culture with A.altissima plant and similar experimental conditions. The roots of the Cd-exposed Seed lings were extracted daily for a week to observe the time course of induction of these Cd-binding proteins. However, only very faint signals were obtained on the autoradiography film perhaps due to slow uptake of Cd in sand culture. In conclusion, we found out the phytochelatins which play role on Cd- tolerance mechanisms of A.altissima. As we searched entire literature, none of similar investigations carried out with this plant haven't been sighted. Especially urban and industrially polluted areas which A.altissima vast spread around, encourage and supports the ideas that it is likely going to be play a major role on solving environmental pollution problems. 71