İn-situ hibridizasyon yöntemi kullanılarak kitin-71 gen klonunun azot fiksasyonu ve nodülasyon esnasında bezelye bitkisinin kök ve nödül dokularındaki ekspresyon yerlerinin belirlenmesi

Abstract

66 6. ÖZET Çalışmada, Rondo bezelye çeşidinin kök tüylerinden izole edilmiş olan KİTİN-71 gen klonu kullanılmış ve bu genin azot fiksasyonu ve nodülasyon esnasında bir markör geni olabileceği düşünülerek, bitki köklerinin neresinde ve ne zaman ekspres edildiği in-situ hibridizasyon yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. Bunun yanında, `kitin- bağlayan-protein` yapısında olan HEVEIN geni ile benzerlikler göstermesi, KİTİN-71 geninin de aynı HEVEIN geninde olduğu gibi bitkide bir savunma mekanizması oluşturabileceğini düşündürmüş ve konu, bu boyutlar çerçevesinde de incelenmiştir. Çimlenmiş bezelye tohumları, baklagil bitki köklerinde nodul oluşturma ve bu sayede havanın serbest azotunu bağlama yeteneğinde olan Rhizobium bakterisinin PRE susu ile aşılanmıştır. Kontrollü koşullar altında gelişmeye bırakılan çimlenmiş bitkilerden 4.- 7.- 10. ve 16. günün sonunda kök ve nodul örnekleri alınmış ve bu örneklerden alınan doku kesitleri in-situ hibridizasyon yöntemi kullanılarak KİTİN-71 geni ile hibridize edilmiştir. Bunun yanında, bakteri ile bulaştırılmamış bezelye köklerinden de tohum çimlenmesinden 4.- 7.- ve 10. günlerin sonunda kök örnekleri alınmış ve aynı yöntem kullanılarak, KİTİN-71 geni hibridize edilmiştir. İlk olarak KİTİN-71 gen dizini, Sac I ve Kpn I restriksiyon enzim bölgelerinden kesilerek, yine aynı enzimlerle kesilmiş pBluescrip II (KS) klonlama vektörünün polylinker bölgesi içine yerleştirilmiştir. Daha sonra bu vektör E.coli bakterisine transfer edilerek çoğaltılmış ve bu sayede yeterli miktarda KİTİN-71 DNA' sı elde edilmiştir. Hibridizasyonda, `antisense RNA` ve `sense RNA` olmak üzere iki KİTİN-71 RNA' sı kullanılmıştır. `Antisense RNA'nın oluşturulmasında ilk olarak, Sac I restriksiyon67 enzimi ile lineer hale getirilmiş ve radyoaktif S35 ile etiketlenmiş DNA denature edilerek, T7 RNA polimeraz yardımıyla DNA'nın 5' -ucundan RNA sentezi başlatılmış, daha sonra dokulara hibridizasyon esnasında, bu RNA'ların dokularda komplementer oldukları mRNA'lara bağlanması sağlanmıştır. `Sense RNA` adı verilen RNA ' m oluşturulmasında ise, Kpn I restriksiyon enzimiyle kesilerek lineer hale getirilmiş ve radyoaktif S35 ile etiketlenmiş DNA denature edilerek, T3 RNA polimeraz yardımıyla DNA'nın 3'- ucundan RNA sentezi başlatılmış, ancak vektör yönünün ters okuma yönünden ve dokularda komplementer mRNA'ların yerine sense RNA'ların homolog dizinlerinin bulunmasından dolayı, çalışmada pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Hibridizasyon sonucunda, genin bakteri ile aşılanmış ve aşılanmamış tüm kök ve nodul dokularında ekspres edildiği belirlenmiş ve bakteri ile aşılanmamış tüm bitki kök dokularında genel olarak gen ekspresyon bölgesi, kambiyum tabakası olarak tespit edilmiştir. Bunun yanında bakteri ile aşılanmış kök ve nodul örneklerinde kambiyum tabakasının yanında, nodul meristematik bölgesinin ve nodul infeksiyon bölgelerinin de gen ekspresyon bölgesi olduğu saptanmıştır. Özellikle, genin nodul yapısını çevreleyecek şekilde ekspres edilmesi dikkati çekmiş ve bu nedenle genin, aynı HEVEIN geninde olduğu gibi bitkide bir savunma mekanizması oluşturabileceği düşünülmüştür. KİTİN- 71 geninin, nodülasyonun farklı dönemlerinde ve olgun bir nodülde ekspres ediliyor olması bu genin azot fiksasyonunda rol oynayan anahtar genlerden biri olduğunu göstermiştir. Özellikle bakteri ile aşılanmamış tüm bitki köklerinde ekspres edilmesi ise, temel bitki genlerinden biri olduğunu da ortaya koymuştur.

68 7. SUMMARY In this study, CHITIN-71 cDNA clone isolated from pea root hairs was used as a genetic material and it was considered that this gene might be a marker gene during nitrogen fixation and nodulation. So, where the CHITIN-71 gene is expressed was searched in plant tissue by ±n-situ hybridization. In addition, sequence analyses of CHITIN-71 gene showed that there were some identity to HEVEIN gene isolated from rubber tree, therefore this gene would play a role on defense mechanism in plant tissue like HEVEIN gene does was thought. Germinated pea seeds were inoculated with PRE strain of Rhizoblum which has ability to fix nitrogen and to form nodules. Root and nodule samples were taken at 4.- 7.- 10.- and 16th days from germinated plants which have grown under sterile conditions inoculated with PRE strain of Rhizobium and these tissues were hybridized with CHITIN-71 gene using In-situ hybridization technique. In addition, noninoculated root samples were taken from 4.- 7.- 10. and 16th days old plants and hybridized with CHITIN-71 gene using the same techniques. First, CHITIN-71 gene was digested with Sac I and Kpn I restriction enzymes and cloned in the polylinker region of pBluescript II (KS) plasmid which has digested with the same restriction enzymes. Later, this vector plasmid was trans fered in to the E.coli to obtain a large amount of CHITIN-71 DNA. During hybridization, Antisense RNA and Sense RNA of CHITIN-71 genes were used. Antisense RNA shows the reading orientation of homologous sequences in plant tissue during hybridization of this gene. Both of them which have linear structures by cutting different restriction enzymes were labelled with radioactives S35.69 Consequently, it was found that the gene was expressed in the all inoculated and uninoculated tissues. Also, cambium layer was found as a gene expression area in the uninoculated plants. In addition to the cambium layer, nodule meristematic area and nodule infection area were found as a gene expression area in the inoculated plants. Especially, the gene was expressed around the nodule structure. Therefore, it was thought that CHITIN-71 would play a role on defense mechanism in the plant system. Because of the expression of CHITIN-71 gene in the different stage of nodulation, CHITIN-71 gene might be one of the genes which has the activity on nitrogen fixation.