Mayada polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yoluyla gen yapısının bozulması

Abstract

VI ÖZET Mayada Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Yoluyla Gen Yapısının Bozulması Metaller biyolojik sistemlerde iz miktarlarda gerekli olmakla beraber yüksek konsantrasyonlarda toksik etkilere neden olurlar. Kadmiyum (Cd+2) metalinin biyolojik fonksiyonu bilinmemekle beraber düşük konsantrasyonlarda bile oldukça toksiktir. Günümüz sanayi ve enerji üretim işlemlerinde kullanılan kadmiyum, sitotoksik ve kanserojen etkisi yüzünden çok önemli bir çevresel kirleticidir. Kadmiyum kirliliği gelecekte çok önemli bir problem olacaktır. Bu yüzden canlı organizmalarda kadmiyum detoksifıkasyonunun moleküler temellerinin anlaşılması çok önemlidir. Maya kadmium faktör (YCF1), Cd+2 ve bazı ilaçlan glutation konjugatlan şeklinde vakuole taşıyan ATP'ye bağımlı ABC (`ATP Binding Cassette`) ailesi proteinidir. YCF1, insan kistik fibrosis transmembran regülatör (CFTR) ve `multi drug` dirençlilik protein (MRPl)'e yüksek derecede homoloji gösterir. Bununla beraber Schizosaccharomyces pombe ' de aynı aileye ait Cd+2 detoksifikasyonundan sorumlu vakuol membranında bulunan HMTİ proteininin, yapılan dendrogram haritalarına göre YCF1 ve CFTR' den farklı olduğu anlaşılmıştır. & pombe de ağır metal toleransında etkili olan genin fizyolojik rolünü bulmak için PCR yoluyla gen bozulması metodu kullanılarak delesyonlu gen oluşturuldu. Gen yapısının bozulması ura4+ ün prob olarak kullanılmasıyla `Dot` melezleme tekniği ile de gösterildi. SAİ olarak adlandırılan mutant Cd+2 yokluğunda üreyebilirken, 5 0-1 00 uM Cd+2 içeren besi ortamında yabani tipe göre üremesi güçlü bir şekilde inhibe edilmektedir. Homolog rekombinasyon yoluyla, ura4D18 haploid hücrelerinde istediğimiz bölgedeki gen yapısının bozulması sonucunda oluşan mutantın minimal besi ortamında üreyebilmesi genin ürünün vegetatif üreme için gerekli olmadığını göstermektedir. Aym genin S. pombe' de Cd+2 toleransında da önemli rol oynadığı anlaşılmıştır. `SWISS-PROT` protein dizi bilgi bankası programına göre bu genin YCF1, MRP1 ve CFTR' ye dizi benzerliği gösteren yeni bir ABC taşıyıcı protein kodladığı doğrulanmaktadır.

VII SUMMARY Polymerase Chain Reaction (PCR) -mediated Gene Disruption in Yeast Metals serve both essential and toxic roles in biological systems. The metal cadmium ( Cd+2) however, is of no known biological utility but is highly toxic at relatively low concentrations. Cadmium pollution occurs as a result of energy generating and manufacturing processes. Therefore cadmium is an environmental contaminant of increasing importance due to its potent cytotoxic effects and its potential carcinogenicity. It is therefore critical to understand the molecular basis of cadmium detoxification in living organisms. The yeast cadmium factor (YCF1) is a vacuolar membrane protein that transport Cd+2 and several drugs as glutathione conjugates (GS-conjugates) and belongs to the superfamily of ABC transporters. YCF1 has strong sequence similarity with human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and multi-drug resistance associated protein (MRP1). However, in Schizosaccharomyces pombe, a vacuolar associated ABC protein (HMT1) plays important roles in Cd+2 detoxification; it is distinct from YCF1 and hCFTR according to the dendrogram created using protein sequences of representative members of the ABC transporter superfamily. To investigate the physiological role of the gene involved heavy metal tolerance, we generated a deletion within the gene by PCR mediated gene disruption in S. pombe. Gene disruption was also verified by Dot hybridization using the ura4+ gene as a probe. This mutant was called SAL In the absence of Cd+2, SA1 grew normally whereas it was effectively inhibited by 50- lOOuM Cd+2 than the wild type. Disruption of the gene in ura4D18 haploid cells, through homologous recombination, demonstrated that the gene product is not required for vegetative growth, but it is essential for Cd+2 tolerance in S. pombe. Based upon primary structural features according to the SWISS-PROT protein sequence database shows that SA1 probably exhibits a new disrupted ABC transporter which has sequence similitary to YCF1, hMRPl and hCFTR.