Oksidatif stres uygulanmış Schizosaccharomyces pombe`de moleküler çalışmalar

Abstract

ÖZETOKSİDATİF STRES UYGULANMIŞ SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE'DEMOLEKÜLER ÇALIŞMALARBu çalışmada, artan oksidatif stres koşullarında Schizosaccharomyces pombe mayahücrelerinin oluşturacağı moleküler cevap hakkında bazı ipuçları elde edilmesihedeflendi. Bu amaçla öncelikle S. pombe'nin üreme eğrisi elde edildi ve oksidatif stresuygulaması için uygun zaman aralığı (hücre sayısının yaklaşık 2x107 hücre/ml değerineulaştığı logaritmik evrenin ortalarına yakın bir aralık) belirlendi. Bu evrede her birdeney grubu, bir saat süreyle 0.2 mM, 1.0 mM, 2.0 mM ve 5.0 mM hidrojen peroksit(H2O2) ile işleme sokuldu.Her gruptaki hücre canlılığı ve H2O2 duyarlılığı, sırasıyla koloni sayım yöntemi vedamla ekim deneyi ile belirlendi. Artan derişimlerdeki H2O2'nin, dolayısıyla oksidatifstresin hücre sayısını belli oranda düşürdüğü ve en yüksek derişimdeki H2O2'nin (5mM) hücre üremesini % 50 oranında inhibe ettiği gözlendi. Işık mikroskobuylagerçekleştirilen analizler bu çalışmada kullanılan stres koşullarının hücre morfolojisinietkilemediğini ortaya koydu.Kontrol (H2O2 uygulanmamış) ve deney gruplarında hücreiçi oksidasyon, lipitperoksidasyonu, indirgenmiş glutatyon (GSH) düzeyi ve katalaz aktivitesi gibi stresparametreleri spektrofluorometrik ve spektrofotometrik yöntemlerle araştırıldı. 0.2 mM,1.0 mM ve 2.0 mM H2O2 uygulamalarının S. pombe'de hücreiçi oksidasyon ve lipitperoksidasyon düzeylerini artırdığı bulundu. 5.0 mM H2O2 uygulanan örnekte ise, bu ikigöstergenin kontroldekilere göre yüksek, fakat diğer deney gruplarındakilere göre düşükolduğu belirlendi. Artan derişimlerdeki H2O2 tüm örneklerde GSH düzeyini kontrolegöre belirgin şekilde düşürdü. Bu sonuç hücre sayıları dikkate alınarakdeğerlendirildiğinde, canlı hücre sayısı kontrole göre düşük olan 0.2 mM H2O2uygulanmış grupta bir uyumluluk cevabının geliştirilmiş olabileceği düşünüldü. 0.2 mMve 1.0 mM H2O2 uygulanmış örneklerde katalaz aktivitesinin yükseldiği, 2.0 mM ve 5.0mM H2O2 uygulanmış örneklerde ise düştüğü gözlendi. Bu bulgularla birincil işleviH2O2'nin uzaklaştırılması olan bu enzimin S. pombe'de antioksidan savunmametabolizmasındaki rolüne ilişkin kapsamlı bir değerlendirme yapılamadı. Buçalışmada ele alınan moleküler parametrelerden özellikle GSH düzeyinin, oksidatifstresin güvenilir bir göstergesi olarak kabul edilebileceği yargısına varıldı. Tümbulgular canlılık oranları dikkate alınarak değerlendirildiğinde, S. pombe'de öldürücüetki yaratmayan, düşük dozda bir oksidatif stresin (örneğin, 0.2 mM'lık H2O2uygulamasının) hücrelerdeki savunma mekanizmalarını uyardığı ve uyumluluğuartırdığı sonucuna varıldı.Bu çalışmada S. pombe'deki bazı güvenilir oksidatif stres göstergeleri ilk keztanımlandı ve S. pombe'nin ökaryotik hücrelerde meydana gelen oksidasyon/redüksiyonreaksiyonlarının moleküler mekanizmalarının aydınlatılması için uygun bir modelsistem olduğu bir kez daha anlaşıldı. Elde edilen verilerin maya ve memeli hücrelerinderedoks dengesi ve bununla ilişkili süreçler konusunda ileride yapılacak çalışmalaratemel oluşturacağı düşünülmektedir.vii

SUMMARYSCHIZOSACCHAROMYCES POMBEMOLECULAR STUDIES ONEXPOSED TO OXIDATIVE STRESSThis study was aimed to find out some evidences on the molecular response ofSchizosaccharomyces pombe yeast cells in increased oxidative stress conditions.For this purpose, primarily the growth curve of S. pombe was evaluated and the propertime (early mid-log phase that the cell number reached approximately 2x107 cell/ml )for oxidative stress treatment was determined. In this period, each experimental groupwas treated with 0.2 mM, 1.0 mM, 2.0 mM ve 5.0 mM hydrogen peroxide (H2O2) forone hour.Cell viability and H2O2 sensitivity of each group was determined by colony countingmethod and spot assay, respectively. It was observed that increased H2O2 concentration,consequently oxidative stress lowered the cell number by a distinct ratio and the highest(5.0 mM) H2O2 concentration inhibited the cell growth by 50 %. Analyses performedwith light microscobe has revealed that oxidative stress conditions used in this study didnot effect the cell morphology.Some oxidative stress parameters such as intracellular oxidation, lipid peroxidation,reduced glutation (GSH) level and catalase activity were examined byspectrofluorometric and spectrophotometric methods in both control (not treated withH2O2) and test groups. It was found that 0.2 mM, 1.0 mM and 2.0 mM H2O2 treatmentsincreased the intracellular oxidation and lipid peroxidation levels in S. pombe. Thesetwo parameters were lower in 5.0 mM H2O2-treated sample then those of control, buthigher then those of the other test groups. Increased H2O2 concentrations caused asignificant decrease in GSH level for all samples compared to the control. When thisfinding was evaluated regarding with the cell numbers, it was estimated that an adaptiveresponse could be progressed in 0.2 mM H2O2-treated sample which has a lower cellviability respect to control group. Catalase activity increased with 0.2 mM or 1.0 mMH2O2 treatment, but decreased with 2.0 mM or 5.0 mM H2O2 treatment. An overallconclusion could not be done related with the role of this enzyme which primaryfunction is decomposition of H2O2 on antioxidant defense metabolism in S. pombe withthese findings. Among the parameters investigated in this study, particularly GSH levelwas approved as a reliable indicator of oxidative stress. When all findings wereevaluated by taking note of cell viability, it was concluded that oxidative stress in asublethal, low dose (for example treatment with 0.2 mM H2O2) stimulated the defencemechanisms in the cells and increased the adaptation in S. pombe.In this study, some of the reliable indicators of oxidative stres in S.pombe weredescribed for the first time and S. pombe has been reconsidered to represent a suitablemodel system for the elucidation of molecular mechanisms of oxidation/reductionreactions take place in eukaryotic cells. Data obtained here is expected to constitute abasis for the further studies on redox balance and related processes in yeast andmammalian cells.viii