Agrobacterium tumefaciens aracılığı ile gen aktarılmış arpa`da (Hordeum vulgare L.) transgen entegrasyonunun analizi

Abstract

Bu tez çalışmasında, Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla gen aktarılmış arpada (Hordeum vulgare L.) transgen entegrasyonunun analizi amaçlandı. Bu amaçla, Hordeum vulgare L. cvs Tokak 157/37 ve Golden promise olgun embriyolarına Agrabacterium aracılığıyla ß-glukoronidaz (GUS) ve neomisin fosfatransferaz II (NPT II) genleri aktarıldı. Gen aktarımından 2 gün sonra transformant embriyolarda GUS gen anlatımı histokimyasal boyama ile doku düzeyinde belirlendi. 40-45 gün sonunda antibiyotik içeren seçici besiyerinde %16.6 oranında Hordeum vulgare cv. Tokak 157/37; ve %10.3 Hordeum vulgare cv. Golden promise transformant bitkisinin canlı kaldığı tespit edildi.Transformant bitkilerde transgen varlığını belirlemek amacıyla öncelikle PZR yapıldı. Hordeum vulgare cv. Tokak 157/37 bitkilerinin %47'sinde ve Hordeum vulgare cv. Golden promise bitkilerinin %44'ünde GUS geni çoğaltıldı. NPT II geni, Tokak 157/37 bitkilerin %77'sinde; Golden promise bitkilerinin %63'ünde pozitif sonuç ortaya koydu.T-DNA entegrasyonunun analizi için PZR temelli bilinenen DNA bölgelerine komşu bilinmeyen dizilerin eldesinde kullanılan ?TAIL? PZR yapıldı. ?TAIL? PZR'de pCAMBIA2301 ikili vektörüne özgün spesifik primerler ile rastgele dejenere (RD) primerler kullanıldı. Analiz edilen 21 bitkiden 3'ünde arpa genomunda T-DNA girişi tespit edildi. Elde edilen arpa genom dizileri veritabanlarında analiz edildiğinde T-DNA'nın ß-galaktosidaz, hsp ve hbc8 gen bölgelerine girdiği belirlendi.

Determination of the transgene integration in barley (Hordeum vulgare L.) following Agrobacterium mediated transformation was aimed in this thesis work. To this end, ß-glucuronidase (GUS) and neomycin phosphotransferase II (NPT II) genes were transfered to mature embryos of the Hordeum vulgare L. cvs. Tokak 157/37 and Golden promise via Agrobacterium. GUS gene expression was observed in transformant embryos at the tissue level by histochemical staining 2 days after Agrobacterium infection. After 40-45 days, 16.6% of the Hordeum vulgare cv. Tokak157/37 and 10.3% of the Hordeum vulgare cv. Golden promise transformants survived on selection medium including antibiotics.PCR was performed to identify putative transgenes in the transformed plants. 47% of the Hordeum vulgare cv. Tokak 157/37 plants and 44% of the Hordeum vulgare cv. Golden promise plants were positive for GUS. On the other hand, 77% of the Tokak 157/37 plants and 63% Golden promise plants were positive for NPT II.TAIL-PCR was used to recover of unknown DNA fragments flanking known sequences was performed for T-DNA integration analysis. Primers which are spesific for pCAMBIA2301 binary vector and arbitrarily degenerated (AD) primers were used for TAIL-PCR. T-DNA insertion was detected in 3 plants of the 21 plants analysed. When the obtained barley genome sequences were analysed by genomic databases; T-DNA has been found in ß-galactosidase, hsp, hbc8 genes.