`C6 glioma hücrelerinde histon deasetilaz inhibitörlerinin ve sinir büyüme faktörü`nün rolü`

Abstract

Histonlardan ve diğer proteinlerden asetil bakiyelerinin çıkarılması, kanser ve nörodejeneratif hastalıklarda terapötik hedef olarak gittikçe yaygın olarak kullanılmaktadır. Histon deasetilaz inhibitörleri bazı genlerin aktivasyonuna sebep olan kromatinde hiperasetilasyonu ve kanser hücrelerinde terminal hücre farklılaşması ve/veya apoptozu uyarmaktadır. Valproik asit (VPA) güçlü antiepileptik, antineoplastik ve nöroprotektif özellikleri bilinen bir ajan olup, merkezi sinir sisteminde nörotropinler dahil çeşitli hedef yapıların ekspresyonunu değiştirebilmektedir. Trikostatin A (TSA) ise ökaryotik hücrelerde büyüme evresinin başlangıcında hücre siklusunu inhibe etmekte ve histonlardan asetil gruplarının uzaklaşmasını engelleyerek yine gen ekspresyonunu değiştirebilmektedir. Bu histon deasetilaz inhibitörleri antitümör aktiviteye ve antiinflamatuvar özelliklere de sahiptir. Sıçan C6 glioma hücrelerinin hem in vitro ve in vivo olarak sinir büyüme faktörü (NGF) reseptörlerini eksprese ettiği ve hem de NGF muamelesi ile bu hücrelerin farklılaşmasına sebep olduğu ve bu hücrelerin çoğalmasını inhibe ettiği bilinmektedir.Bu çalışma, iki farklı histon deasetilaz inhibitör sınıfına ait olan VPA ve TSA'nın ikili kombinasyonunun C6 glioma hücrelerinde in vitro olarak özellikle apoptoz ve hücre proliferasyon mekanizmaları üzerindeki etkisinin NGF uygulanması ile etkilenip etkilenmeyeceğini ortaya koymak amacıyla tasarlanmıştır. Böylelikle C6 glioma hücrelerinde tam olarak açıklanamayan hücre ölüm mekanizmasının moleküler düzeyde incelenmesi amaçlanmıştır.Bütün bu veriler dikkate alınarak, C6 glioma hücrelerini tedavi etmek amacı ile iki histon deasetilaz inhibitörü farklı dozlarda ve sürelerde tek tek ve kombine olarak uygulandı ve apoptotik hücre indeksi ile hücre çoğalma indeksi hesaplandı. Ayrıca bu histon deasetilaz inhibitörlerinin C6 glioma hücrelerinde in vitro olarak özellikle apoptoz ve hücre proliferasyon mekanizmaları üzerindeki etkisinin NGF'nin uygulanması ile etkilenip etkilenmediği de tespit edildi. Çalışmada kaspaz-3 aktivitesi, P75NTR, TrkA immunohistokimyasal olarak, NGF miktarı, hücre proliferasyonu ve apoptoz ise kolorimetrik (ELISA) olarak incelendi.Sonuç olarak VPA, TSA ve NGF tek tek, ikili VPA+TSA ve üçlü VPA+TSA+NGF kombinasyonlar halinde uygulandığında C6 glioma hücrelerinin çoğalmasının engellendiği ve bu hücrelerin apoptoza gittiği gözlendi. Tüm bu veriler göz önünde bulundurulduğunda, HDAC inhibitörleri ile NGF kombinasyonunun, C6 glioma hücre soyu üzerinde meydana getirdiği apoptotik hücre ölümü ile, nörodejeneratif hastalıkların ve gliyal kökenli beyin kanserinin tedavisinde kullanılacak terapötik ajanlar olabileceği öne sürülebilir.

Removal of acetyl moieties from histones and other proteins is used widely as a therapeutic aim in cancer and neurodegenerative diseases. Histone deacetylase inhibitors stimulate the hyperacetylation in chromatin, which causes activation of some genes and it also stimulates the terminal cell differentiation and/or apoptosis. Valproic acid (VPA) is an agent whose powerful antiepileptic, antineoplastic and neuroprotective features are known and it can change the expression of several targets including neurotrophines in central nervous system. Trichostatin A (TSA) inhibites cellular cycle in the beginning of growth period in eucaryotic cells and it can change gene expression by inhibiting removal of acetyl groups from histones. These histone deacetylase inhibitors have antitumour activity and antiinflammatory properties. It is known that rat C6 glioma cells express nerve growth factor (NGF) receptors both in vitro and in vivo, and they also cause differentiation of these cells, leading to inhibition of their proliferation.This study is designed to determine the effects of two histone deacetylase inhibitors in combined manner on especially apoptosis and cellular proliferation mechanism in C6 glioma cells and relationship to the administration of NGF. Therefore, it was aimed to investigate the inexplicable cell death mechanism of C6 glioma cells at molecular level.By considering all these findings, VPA and TSA administered different doses and periods (individually and in combined manner) and apoptotic cellular index and cellular proliferation index calculated. In addition, the effect of these histone deacetylase inhibitors in vitro on especially apotosis and cellular proliferation mechanisms in C6 glioma cells, the relationship to the administration of NGF are determined. In this study, caspase-3 activity, P75NTR and TrkA determined with immunocytochemical manner whereas the NGF levels, cell proliferation and cell death determined with colorimetric (ELISA) manner.As a result, we report that VPA, TSA and NGF individually and combined manner inhibit the cell proliferation of C6 glioma cells and trigger apoptosis. By considering these findings, we suggest that VPA, TSA and NGF combination may be new therapeutic agents in the therapy of neurodegenerative diseases and glial derivative brain cancer.