Buğday (Triticum aestivum L.) proteomik çalışmalarında yeni nesil iki boyutlu sıvı kromatografi (2D-LC) sistemi kullanımı

Abstract

Proteom çalışmaları, bir biyolojik sistemde, belirli bir evrede mevcut biyolojik süreçlerde görevli olan tüm proteinlerin analiz edilmesine olanak sağlar. Bu çalışmalar, özellikle bitkilerde son derece karmaşık olan biyotik/abiyotik stres toleransı cevabında etkin veriler ortaya koyması nedeniyle önemlidir. Ancak diğer organizmalarla karşılaştırıldığında bitkilerde proteomik çalışmaların son derece az olduğu görülmektedir. Bunun en önemli nedenleri bitkisel dokulardaki sert hücre çeperleri, çok çeşitli pigmentlerin ve sekonder metabolitlerin varlığı nedeniyle ortaya çıkan metadolojik sıkıntılardır. Sunulan tez çalışması kapsamında, yeni nesil teknolojilerden yararlanılarak bu sıkıntıların azaltılması ve bitkilerde proteomik çalışmaların yaygınlaştırılmasına katkı sağlanması hedeflenmiştir.Proteom çalışmalarında çeşitli evrelerde bulunan farklı birçok hücrenin oluşturduğu dokuların parçalanması sonucunda meydana gelen protein karışımının ayrılması gereklidir. Protein karışımlarının ayrımında iki boyutlu jel (2D-PAGE) sistemleri günümüzde halen yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak bu yöntemin önemli dezavantajları nedeniyle son yıllarda iki boyutlu sıvı kromatografi (2D-LC) sistemleri geliştirilmiştir. Bu sistemler çok sayıda total protein örneğinin daha hızlı, güvenilir ve güçlü biçimde ayrımı sağlanabilmektedir. Bu nedenle tez çalışması kapsamında bir 2D-LC sistemi olan PF-2D'nin bitki proteomik çalışmalarında kullanılmak üzere optimizasyonu yapılmış ve bu çalışmalar tamamlandıktan sonra da sistemin kullanılabilirliğini ortaya koymak üzere bir model çalışma gerçekleştirilmiştir.Bu amaçla buğdayda, Puccinia striiformis f. sp. tritici adlı biyotrofik mantarın neden olduğu sarı pas hastalığına dayanıklılıkta rol alan proteinlerin belirlenmesi yönünde çalışmalar yapılmıştır. Enfeksiyonun 72. saatinde, kontrol ve enfekte bitkilerden yaprak örnekleri alınarak protein izolasyonu yapılmış, ardından proteinler PF-2D siteminde iki boyutlu ayrılarak tek tek karşılaştırılmıştır. Bu karşılaştırmalarda farklı anlatım düzeyi gösteren proteinler LC-ESI-MS/MS ile tanımlanmışlardır.

Proteom studies allow the analysis of all proteins which have a role in the biological process in a biological system at a particular phase. Proteomic is very important to produce the efficient data about extremely complex response against to the biotic/abiotic stress in plants. However in plants the number of the proteomic study is very low compared with other organisms because of their rigid cell walls, complex and a wide variety of secondary metabolites, pigments, proteases, polyphenols, polysaccharides, starch and lipids. In the present thesis is aimed to reduce the metodological restirictions by using the new techonologies and contribute of the dissemination of the plant proteomics.In a proteomic study, a protein mixture occurs as a result of disintegration of tissue which are composed of many different cells at different phases. First and most important step of proteomic is seperation of all proteins in this mixture. Two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) are widely used for his step. But this metod has lots of disadvantages such as loss of hidrofobic proteins, application difficulties, low reproducibility, take a long time vs. Therefore in recent year, two-dimensional liquid chromatography (2D-LC) systems are developed to provide faster, reliable and powerful separation of large number of total protein samples. In the scope of the thesis PF-2D which is a 2D-LC system, is optimized for using the plant proteomic studies. After completion of the optimization studies, a model study carried out for demostrate the utility of the systemFor this purpose, a study on wheat was performed to determine of the proteins that have role on resistance mechanism against to yellow rust disease which is caused by Puccinia striiformis f. sp. tritici. At the 72. hours after inoculation, the leaf samples were harvested from infected and non-infected control plants to isolate total proteins. Afterwards the proteins are seprated by PF-2D system and compared one by one. In this comparasions differentialy expressed proteins were selected and identified by LC-ESI-MS/MS.