Pankreatik β-hücre farklılaşmasında bazı histon deasetilazların rolü

Abstract

Pankreatik gelişim sırasında, transkripsiyon faktörleri ekzokrin ve endokrin farklılaşmada önemli rol oynarlar. Transkripsiyon faktörlerinin, görevlerini yerine getirebilmeleri genin yapısal durumuna bağlıdır. Epigenetik düzenlenmeyi ortaya çıkaran önemli enzim gruplarından bir tanesi olan Histon deasetilaz (HDAC)'lar pankreas gelişimi sırasında süregelen hücre farklılaşmasında çok önemli roller üstlenirler. Valproik Asit (VPA), sınıf I HDAC engelleyicisi olarak bilinen küçük molekül yapısında kimyasal bir bileşiktir. Bu çalışmada, pankreatik adacık kaynaklı mezenkimal kök hücre (PA-MKH)'lere 20 gün boyunca VPA ve/veya glukoz uygulanarak pankreatik β-hücre farklılaşması ve ilişkili moleküler mekanizmanın araştırılması amaçlanmıştır. Çalışma kapsamında literatürde ilk kez PAK-MKH'lerde sınıf I HDAC'ların pluripotensi faktörleri üzerine olan etkileri araştırılmıştır. Bu faktörler kök hücre karakterlerinin korunması ve fonksiyonlarının devamlılığının sağlanmasında temel rol üstlenen Oct ¾, c-Myc ve Nanog'tur. Ayrıca, HDAC'lar, pluripontensi faktörleri, erken pankreatik gelişim, kompenzasyon ve β-hücre fonksiyonu ile ilgili olmak üzere dört gruptan seçilen toplam 39 adet mikroRNA (miRNA)'nın gen ekspresyon düzeylerindeki değişimler araştırılmıştır. HDAC inhibitörlerinin PA-MKH üzerine etkilerinin daha önce araştırılmamış olması çalışmamızın özgünlüğünü açıkça ortaya koymaktadır.Bu çalışma kapsamında PAK-MKH'lere, glukoz ve/veya VPA uygulanarak bu hücrelerin β-hücrelerine farklılaşma oranı insülin üreten hücrelerin flow sitometrik yöntemle ve ELISA yöntemiyle insülin sekresyonun ölçülmesiyle belirlendi. Ayrıca Pdx-1, Pax4, Nkx6.1, Neurogenin-3, ins2 ve Glut-2'nin gen ekspresyonu seviyelerinin gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile ölçülmesi ile β-hücre farklılaşması bulguları desteklendi. Pluripotent karakter ile ilgili değişiklikleri inceleyebilmek için, Oct3/4, c-Myc ve Nanog transkripsiyon faktörlerinin seviyelerindeki değişimler western emdirimi yöntemi ile belirlendi. Pankreatik β-hücre farklılaşmasında önemli olduğunu düşünülen sınıf I HDAC'lardan HDAC1 ve asetilenmiş H3 ve H4 ile metillenmiş H3 seviyelerindeki değişiklikler de western emdirimi yöntemiyle ölçüldü. β-hücre farklılaşmasında etkili olabileceğinidüşündüğümüz aynı zamanda epigenetik süreçte önemli rol alan bazı miRNA'ların gen ekspresyon seviyelerindeki değişimler qRT-PCR yöntemi ile belirlendi.Sonuç olarak, bu çalışma, PAK-MKH'lerin β-hücrelerine farklılaşmasını kontrol eden epigenetik mekanizmanın aydınlatılmasına önemli katkılar sağlamıştır. Sınıf I HDAC'lar ile miR-18a, miR-19b, miR-30d, miR-124, miR-146a, miR-184, miR-335, miR-433-5p ve miR-503'ün bu farklılaşmanın gerçekleşebilmesinde rol aldığı tespit edilmiştir. Dolayısıyla, çalışmamız β-hücre farklılaşması sürecinin kontrolü açısından, yeni bir bakış açısı oluşturarak, hem süreci anlama hem de özellikle T2D'nin hücresel tedavisi için kullanılabilecek yeni moleküllerin keşfine zemin hazırlayabilecek niteliktedir.

Transcription factors play a crucial role in differentiation to endocrine and exocrine parts of pancreas during pancreatic development. Performing the functions of transcription factors is dependent on structural condition of the gene. Histone deacetylases (HDACs) are one of important enzyme group revealing epigenetic regulation, play important roles in cell differentiaton during pancreas development. Valproic acid (VPA), is known as a small chemical compound and class I HDACs inhibitor. In this study, it was aimed to investigate the pancreatic β-cell differentiaton and relevant molecular mechanism by administering VPA and/or glucose to pancreatic-islet derived mesenchymal stem cells (PID-MSCs) for 20 days. Within the context of our study, the effects of class I HDACs on pluripotency factors in PID-MSCs are investigated for the first time in literature. These factors are Oct ¾, c-Myc and Nanog that play a fundamental role in maintaining stem cell character and providing their functional continuity. Besides, totaly 39 miRNA selected from four groups related to HDACs, pluripotency factors, early pancreatic development-compensation stage and β-cell function, are investigated in terms of changing in the level of gene expression. The effect of HDAC inhibitors on PID-MSCs did not study before, so it clearly reveals the originality of our work.Within the context of this study, the differentiation of PID-MSCs to β-cells by administration of glucose and/or VPA to these cells, insulin-producing cells are determined by flow cytometric analysis and insulin secretion levels are measured by ELISA method. Moreover, the findings of differentiaton to β-cell are supported by measuring the gene expression levels of Pdx-1, Pax4, Nkx6.1, Neurogenin-3, ins1/2 and Glut2 by using real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). For examining the changes related to pluripotent character, the changes in the levels of Oct3/4, c-Myc, and Nanog transcription factors are determined by western blotting. Class I HDACs are considered important for pancreatic β-cell diffentiation. Also, the changes in the levels of HDAC1 and acetylated H3/H4 and methylated H3 are determined by western blotting. Some miRNAs that we think as important in β-cell differentiation and at the same time in epigenetic stage are determined by qRT-PCR.Consequently, this study made a significant contribution for illuminating the epigenetic mechanism that controls the differentiation of PID-MSCs to β-cells. It was determined that Class I HDACs with miR-18a, miR-19b, mir-30d, miR-124, miR-146a, miR-184, miR-335, miR-433-5p and miR-503 take place in this differentiaton process. Therefore, our investigation laid the groundwork to understand the process and discover new molecules could be used for cellular treatment of T2D by creating a new approach in terms of controlling of β-cell differentiation process.