Oksidatif protein hasarı ve antioksidanların önleyici etkisinin belirlenmesi için bir sensör geliştirilmesi

Abstract

Günümüzde oksidatif stres kavramı, tüm dünyada kimyasal, biyolojik, tıbbı vb. çeşitli alanlarda yapılan araştırmalar arasında önemli bir yer tutmaktadır. Serbest radikaller canlı organizmalarda sürekli üretilmekle birlikte çeşitli antioksidan savunma sistemleriyle düzenlemektedir. Serbest radikallerin aşırı üretimi sonucu, miktarlarının antioksidanlarca dengelenememesi oksidatif stres olarak tanımlanır ve protein, DNA, RNA, lipid, karbonhidratlar dahil olmak üzere biyolojik olarak önemli moleküller üzerine hasar oluşumuna ve bundan kaynaklanan çok sayıda hastalığa neden olabilir. Son yıllarda sensörler, düşük maliyetleri, kolay kullanımları, analitin hızlı tayin edilebilmesi ve yüksek hassasiyet gibi avantajları nedeniyle çeşitli hastalıkların takibi ve tedavisi için taşınabilir aletler geliştirilmesinde, gıda ve ilaçların kontrollerinde, adli kimyada veya biyomedikal araştırmalar gibi çeşitli alanlarda başarıyla uygulanmaktadır. Bu nedenle, tez çalışmasının amacı oksidatif protein hasarı ve antioksidanların önleyici etkisinin belirlenmesi için bir sensör geliştirilmesidir. Bu çalışmada CUPRAC reaktifi (Cu(II)-Nc) nafyon membran yüzeyine tutturularak oksidatif protein hasarı ve antioksidanların önleyici etkisinin belirlenmesi için kullanılan optik sensör elde edildi. Protein örnekleri olarak bovin serum albümin (BSA), kazein ve yumurta akı kullanıldı. Fenton Yöntemiyle oluşturulan hidroksil radikali ile oksidatif hasara uğratılan protein örneklerinde meydana gelen bu hasarın belirlenmesi için CUPRAC sensörü uygulandı. İşlem askorbik asit, gallik asit, glutatyon, sistein, N-asetil sistein bileşikleri varlığında tekrarlanarak antioksidanların oksidatif protein hasarı üzerine engelleyici etkisi incelendi. CUPRAC tayin yöntemi ayrıca çözelti ortamında da gerçekleştirildi ve CUPRAC yöntemiyle sensör üzerinde ve çözelti ortamında yapılan ölçümlerle elde edilen sonuçlar arasında yüksek bir korelasyon görüldü (çoğu denemelerde, R2> 95). Dünya literatüründe karbonil grubu oksidatif protein hasarının genel belirteci olarak tanımlanmış olup bu çalışmada karbonil tayini yöntemi standart referans yöntem olarak uygulanmıştır. Tezin kapsamında kullanılan karbonil tayini yöntemi, oksidatif hasara uğratılan proteinlerin karbonil türevleri üzerine 2,4-Dinitrofenilhidrazin (DNPH) eklenmesiyle meydana gelen 2,4-dinitrofenilhidrazon bileşiğinin bazik ortamda şarap – kırmızı renkli anyon şekline dönüştürülmesiyle elde edilen absorbansın 450 nm'de okunmasına dayanmaktadır. Çalışmada protein örnekleri Fenton sisteminde antioksidanların varlığında ve yokluğunda oksidatif hasara uğratıldı, meydana gelen karbonil türevlerinden kaynaklanan absorbanstaki azalma değerlendirilerek antioksidanlar oksidatif protein hasarından koruyucu etkilerine göre sıralandı. Spearman sıra-korelasyon katsayısı istatistiklerine göre (p = 0,05), CUPRAC tarafından belirlenen antioksidan sıralaması ile protein oksidasyonuna karşı verdikleri yanıttan dolayı önerilen protein karbonil metodu sıralaması arasında monotonik olarak `çok güçlü` bir ilişki (rS = +0,9'den +1,0) olduğu belirlendi. Araştırılan bileşikler arasında antioksidan kapasitesi en yüksek olan Gallik asit olarak belirlendi. Proteinlerin oksidatif hasarının önlenmesi için antioksidan aktivite belirlenmesinde kullanılan modifiye CUPRAC yönteminin geliştirilmesi ve aynı amaca dönük tasarlanan bazik karbonil yönteminde yüzey aktif varlığında çözücü özütlemenin kullanılması, çalışmanın iki özgün katkısını oluşturmaktadır.

In last few decades, the term oxidative stress has attracted sharp attention in the field of chemical, biological and medical researches around the world. Free radicals are continuously formed in living organisms and regulated with antioxidant systems in living organisms. The production of excessive amounts of free radicals that could overwhelm the antioxidant capacity of the system causes oxidative stress and as a result, various diseases are formed due to damages on biologically important molecules, including protein, DNA, RNA, lipid and carbohydrates. On the other hand, the sensor technology is rapidly introduced for wide range of areas such as monitoring of treatment and disease, food and drug control and forensic and biomedical researches, due to its advantages, including low cost operation, ease of use, rapid determination and high sensitivity. Therefore, the purpose of the thesis is to develop a sensor for determination of oxidative protein damage and of the protective effect of antioxidants on this damage. Within the frame of thesis, an optical sensor was developed to evaluate oxidative protein damage and antioxidant protection through immobilizing CUPRAC reagents (Cu(II)-Nc) on nafion membrane. In this study, BSA, casein and egg white proteins were used as protein probes and their hydroxyl radical induced oxidative damage in Fenton system was carried out with the CUPRAC sensor. Determination of oxidative damage of proteins by CUPRAC sensor was followed with a number of antioxidants to identify protective effect of antioxidant compounds (ascorbic acid, gallic acid, glutathione, cysteine and N-acetyl cysteine) on oxidative protein damage. Furthermore, CUPRAC assay was also applied in solution medium to measure oxidative protein damage and antioxidant protective effect and there was high correlation found between results obtained with CUPRAC sensor and CUPRAC solution methods (in most cases, R2 > 95). As it is well known that carbonyl groups are generic markers for the oxidative protein damage, protein carbonyl assay was conducted as the standard reference method in the present study. The principle of carbonyl assay used in this study is based on read absorbance of wine colored anion of 2,4-dinitrophenylhydrazone. This anion is produced in basic media from the 2,4-dinitrophenylhidrazone derivatives, which are formed in the reaction between carbonylized derivatives of damaged protein and 2,4-dinitrıphenyl hydrazine (DNPH) reagent. Protein samples were oxidized in the Fenton system with and without the presence of AOs, and based on decreases in absorbance of produced carbonyl derivatives, studied AOs were ranked with respect to their protective effect on oxidative protein damage. The Spearman rank order correlation analysis resulted that there was a monotonically increasing `very strong` association (rS = +0.9 to +1.0; p=0.05) found between two ranks of AOs obtained through CUPRAC solution method and carbonyl assay in this study. Among the studied AOs, the strongest antioxidant activity was found for Gallic acid. The two novelty statements of this thesis work may be declared as: (i) development of a modified CUPRAC method for measuring the antioxidant activity of protein damage protective compounds, and (ii) design of an alkaline carbonyl method in conjunction with surfactant-assisted solvent extraction used for the same purpose.