Farklı bitki ekstrelerinin in vitro antikanser aktivitelerinin değerlendirilmesi

Abstract

Bitkiler, birçok hastalığın tedavisinde kullanılma potansiyeli olan çok sayıda doğal bileşik içerirler. Bu bileşiklerin keşfi için öncelikle bitki ekstrelerinin biyoaktivitelerinin belirlenmesi gerekir.Bu tez çalışmasının amacı, antikanser aktivite potansiyeli olan yeni doğal bileşikleri içeren bitki ekstrelerinin belirlenmesidir. Bu kapsamda, 3'ü Türkiye'ye endemik (Centaurea kilaea, Centaurea hermannii, Kitaibelia balansae) olan toplam 8 (Crataegus orientalis, Centaurea kilaea, Centaurea hermannii, Crataegus monogyna, Kitaibelia balansae, Plantago lanceolata Centaurea behen) metanolik bitki ekstresinin Vero [Afrika Yeşil Maymun (Cercopithecus aethiops) böbrek fibroblast hücre hattı] ve HeLa (insan serviks kanseri epitel hücre hattı) hücreleri üzerinde sitotoksik etkilerini MTT kolorimetrik yöntemi ile belirlenmiştir. Çalışılan bitki ekstrelerinden en yüksek antikanser aktivite C. hermannii ekstresi tarafından ortaya konulmuştur. Potansiyel antikanser aktiviteye sahip olan C. hermannii bitki ekstresinin Vero ve HeLa hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkisini doğrulamak amacıyla xCELLigence RTCA sistemi ile hücre indeksi parametreleri belirlenmiştir. Daha sonra C. hermannii ekstresinin hücre ikilenme süresini nasıl etkilediğini ortaya koymak amacıyla Karboksi Floresein Suksinimidil Ester (CFSE) ve hücre siklusuna olan etkilerini belirlemek için Propidium İyodür (PI) boyama yöntemleri kullanılmıştır.MTT analizi ile 48. saatte elde edilen veriler değerlendirildiğinde C. hermannii ekstresinin normal transforme hücre hattı Vero'daki düşük sitotoksisitesi ve serviks kanseri hücre hattı HeLa'daki seçici yüksek sitotoksisitesi potansiyel antikanser aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir. C. hermannii bitki ekstresinin Vero ve HeLa hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkisini belirlemek amacıyla elde edilen verilerle IC50 (Hücrelerin %50'sinin ölümüne neden olan ekstre konsantrasyonu) ve SI (Seçicilik indeksi; SI= IC50 Vero hücresi / IC50 HeLa hücresi) değerleri hesaplanmıştır. C. hermannii bitki ekstresi IC50 değerleri Vero hücre hattı için 399,8 μg/mL, HeLa hücre hattı için 29,44 μg/mL olarak bulunmuştur. SI değeri ise 11,88 olarak hesaplanmıştır.C. hermannii için xCELLigence RTCA sistemi ile hücre indeksi parametrelerinin analizi sonucunda elde edilen IC50 değerleri Vero hücre hattı için 364,98 μg/mL ve HeLa hücre hattı için 28,91 μg/mL olarak bulunmuştur. SI değeri ise 12,62 olarak hesaplanmıştır. MTT analizinden elde edilen veriler hem morfolojik değerlendirmeler ile hem de xCELLigence sistemi ile yapılan analiz sonuçlarıyla tutarlıdır.C. hermannii bitki ekstresi uygulanmış ve uygulanmamış (kontrol) HeLa hücrelerinin CFSE boyama ile elde edilen sonuçları değerlendirildiğinde 24. saatte, kontrol grubunun 2 olan bölünme indeksinin konsantrasyon artışına paralel olarak 1,55'e düştüğü, 48. saatte ise 3,43 olan bölünme indeksinin konsantrasyon artışına paralel olarak 2,05'e düştüğü belirlenmiştir. C. hermanni bitki ekstresi uygulanmış ve uygulanmamış (kontrol) HeLa hücrelerinin 48. saat PI boyama ile elde edilen hücre siklusu analiz değerleri incelendiğinde, kontrol grubunun yapılan analizleri sonucu popülasyonun %80,5'inin G0-G1 fazında %2,22'lik kısmının S fazında ve %13,8'lik kısmının ise G2-M fazında olduğu belirlenmiştir. Spontan olarak meydana gelen parçalanmaların ise %4 civarında olduğu hesaplanmıştır. 25 µg/mL konsantrasyonda, popülasyonun %55,2'si G0-G1 fazında %9,32'lik kısmının S fazında ve %23,6'lik kısmının ise G2-M fazında olduğu belirlenmiştir. Hücrelerin parçalanması ile oluşan küçük boyutlu parçaların oranı ise %11,89'dir. 100 µg/mL konsantrasyonda ise, popülasyonun %4,18'i G0-G1 fazında, %17,8'i S fazında, %51,2'si ise G2-M fazında olduğu belirlenmiştir. Hücrelerin parçalanması ile oluşan küçük boyutlu parçaların oranı ise %16,82'dir. C. hermannii bitki ekstresinin, HeLa hücre popülasyonunun hücre siklus dağılımlarını anlamlı ölçüde değiştirmesi MTT, xCELLigence ve CFSE yöntemleri ile ortaya konan etkilerini doğrulayan bir sonuç olarak değerlendirilmektedir.

Plants contain a large number of natural compounds which are potentially useful in the treatment of many diseases. The bioactivity of plant extracts must be determined for the discovery of these compounds.Aim of this study, cytotoxic effects of the methanolic extracts of 8 plants (Crataegus orientalis, Centaurea kilaea, Centaurea hermannii, Crataegus monogyna, Kitaibelia balansae, Plantago lanceolata Centaurea behen), 3 of which are endemic species to Turkey (Centaurea kilaea, Centaurea hermannii, Kitaibelia balansae), on Vero [African green monkey (Cercopithecus aethiops) kidney fibroblast cell line] and HeLa (human cervical carcinoma epithelial cell line) cells were determined by mitochondrial dehydrogenase activity, MTT, colorimetric method. From the plant extracts studied, the highest antitumoral activity was revealed by Centaurea hermannii extract. In order to confirm the cytotoxic effect of Centaurea hermannii plant extract having potential anticancer activity on Vero and HeLa cell lines, cell-index parameters were determined with xCELLigence RTCA system. Then, Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) method was used to investigate how C. hermannii extract affected cell duplication and the Propidium Iodide (PI) staining method was used to determine the effects on the cell cycle. When the data obtained at 48th hour by MTT analysis is evaluated, the low cytotoxicity in the normal transformed cell line Vero and the selective high cytotoxicity in the cervical cancer cell line HeLa suggest that C. hermannii extract has potential anticancer activity. IC50 (extract concentration causing 50% of cells death) and SI (selectivity index; SI = IC50 Vero cell / IC50 HeLa cell) values were calculated to determine the cytotoxic effect of C. hermannii plant extract on Vero and HeLa cell lines. The IC50 values of the C. hermannii plant extract were 399.8 μg / mL for the Vero cell line and 29.44 μg/mL for the HeLa cell line. SI value is calculated as 11.88.The IC50 values of C. hermannii obtained from the analysis of cell index parameters by the xCELLigence RTCA system were 364.98 μg / mL for the Vero cell line and 28.91 μg / mL for the HeLa cell line.SI value is calculated as 12.62. The data obtained from the MTT assay is consistent with both the morphological assessments and the results from the xCELLigence system.When the results obtained by CFSE staining of Centaurea hermannii plant extract treated and untreated (control) HeLa cells were evaluated at 24th hour, the cleavage index of the control group which is 2 decreased to 1.55 in parallel with the increase in concentration, and at the 48th hour the cleavage index decreased from 3.43 to 2.05 in parallel with the increase in concentration.When cell cycle analysis values obtained by PI staining of Centaurea hermannii plant extract treated and untreated (control) HeLa cells at 48th hour were examined, analysis of the control group revealed that 80.5% of the population is in the G0-G1 phase, 2.22% is in the S phase and 13.8% is in the G2-M phase. The spontaneous fragments are calculated as about 4%. At 25 μg / mL concentration, it was determined that 55.2 % of the population was in S phase and 9.32 % of in G0-G1 phase and 23.6 % of in G2-M phase. The proportion of the small sized pieces formed by the disintegration of the cells is 11.89%. At the concentration of 100 μg / mL, it was determined that 4.18 % of the population in G0-G1 phase, 17.8 % of in S phase, and 51.2 % of in the G2-M phase. The proportion of the small sized pieces formed by the disintegration of the cells is 16.82%. The significant change in cell cycle distributions of the HeLa cell population by C. hermannii plant extract is assessed as a result confirming the effects of C. hermannii plant extract by MTT, xCELLigence and CFSE methods.