Bikarbonat tarafından uyarılan adenozin 5`-trifosfataz enziminin sıçan beyni iskemisindeki rolü

Abstract

Bu çalışma HCO-3 tarafından uyarılan Adenozin 5'-Trifosfataz enzimi için en ideal inkübasyon koşullarının saptanması ve HCO-3 tarafından uyarılan Adenozin 5 '-Trifosfataz ' in kinetik özelliklerinin araştırması amacıyla yapılmıştır. Çalışmada kullanılan Wistar türü sıçanların (150-250 gr.) beyin gri dokusundan mikrozomal fraksiyonu eldesinde sukroz ile homojenizasyon ve santrifüj teknikleri kullanılmıştır. ATP'den açığa çıkan inorganik fosfatın ölçülmesi prensibine dayanılarak saptanmıştır. Çalışmamızda ilk önce HC0~3 tarafından uyarılan Adenozin 5 '-Trifosfataz' ın ideal inkübasyon koşullarını saptamak amacı ile parametrelerin hepsi sabit tutulup biri değişken kabul edilerek ideal inkübasyon ortamı ve kinetik parametreleri ölçülmüştür. Bu amaçla ilk önce ATP'nin etkisi araştırmak amacı ile inkübasyon ortamına değişik konsantrasyonlarda ATP ilave edilip HC0-3 tarafından uyarılan Adenozin 5' -Trifosfataz'ın spesifik enzim aktivitesi ölçülmüştür, ve inkübasyon ortamına 3.3 mM ATP ilavesi ile enzim aktivitesinin maksimum noktasına ulaştığı saptanmıştır. Aynı şekilde inkübasyon ortamına değişik konsantrasyonlarda NaHC0.3 ilave edilerek bikarbonatın enzim aktivitesi üzerine olan etkisi araştırılmıştır. Enzim aktivitesinin 30 mM NaHC0.3 konsantrasyonu kadar arttığı ve daha sonra sabit -88-kaldığı hatta daha fazla NaHC03 ilavesi ile hafif bir inhibisyon gözlenmiştir. MgCl2 'nin değişik konsantrasyonlarının enzim aktivitesi üzerine etkisi araştırılmıştır. Yine 15 mM MgCla ilavesinde spesifik aktivite maksimum noktasına ulaşmıştır. İnkübasyon ortamına konulan tamponun etkilerinin araştırılması amacı ile değişik pH'larda Tris tamponu hazırlanarak inkübasyon ortamına ilave edilmiştir ve pH 8' de maksimum aktivite ölçülmüş asın düşük pH'larda ve yüksek pH'da enzimin inhibe olduğu gözlenmiştir. Isının etkisini araştırmak amacı ile inkübasyon ortamının ısısı değiştirilmiş, farklı ısılarda aktivite ölçülerek 37°C'de aktivitenin en yüksek noktaya ulaştığı ve Arhenyus grafiği ile enzimin bir geçiş sıcaklığı olduğu saptanmıştır. Sonuç olarak HCO-3-ATPaz için en ideal inkübasyon ortamının 20 mM Tris tamponu, 2mM MgCl2, 1mM Ouabain, 20 mM NaHC03, 3 mM ATP oluştuğu saptanmıştır. HC0-3-ATPaz ' in kinetik özellikleri çalışmış ATP için M.Menten ve Lineweaver-Burk, Eadie hostee ve Hones Half grafikleri çizilmiştir. Km ve Vmax'lari hesaplanarak karşılaştırılmıştır. öte yandan ATP için Hils grafiği çizilmiştir ve n=l enziminin bir bağlaç yöresi olduğu saptanmıştır. -89-HC0-.3 ilavesi ile yine M.Menten grafiği çizilmiş ve MgCla ilavesi ile yine aynı kinetik parametrelere bakılmıştır. Tamura tarafından önerilen deneysel iskemi modeli uygulanmış, elde edilen homojenatlarda lipid peroksidasyon ürünü olan MDA ve HCO-3 tarafından uyarılan Adenozin 5'- Trifosfataz aktivitesi ölçülmüştür. Yine deneysel iskemi uygulamadan önce metil prednizolon verilen tedavi grubu oluşturulmuştur ve bu grupta da HCO_s-ATPaz ve lipid peroksidasyonu ürünü olan MDA ölçülmüştür. Sonuç olarak iskemi grubunda HCO-3-ATPaz enzim aktivitesinin kontrol grubuna göre azaldığı tedavi grubunda ise iskemi gruba göre artış gösterdiği, MDA miktarının ise iskemi grubunda artış, gösterdiği tedavi grubunda ise azaldığı gözlendi. -90-

SUMMARY This study aims to determine ideal incubation conditions for and kinetic features of Adenosine 5 ' -Triphosphatase enzyme stimulated by bicarbonate. In obtaining microsomal fractions from grey matter of the brains of Wistar type rats, sucrose, homogenization. and centrifuge techniques were employed in this study. Measurement of enzyme activity is based on measurement of inorganic phosphate released by ATP. In the study, in order to determine ideal incubation conditions for Adenosine 5 '-Triphosphatase stimulated by HCO-3, first, ideal incubation conditions and kinetic- parameters were measured, holding all parameters constant, except one. To that end. in order to first investigate the efect of ATP specific enzyme activity of Adenosine 5 ' -Triphosphatase was measured, adding different ATP concentrations of varyina amounts to the incubation setting. It was determined that enzyme activity had reached the maximum level, due to addition of 3.0mM ATP. Similarly, the effect of bicarbonate on enzyme activity- was investigated, by adding different NaHCOa concentrations to the incubation conditions. -91-It was also found out that enzyme activity first increased as much as 30 mM NaHC03 concentration, and then remained constant, then an inhibition was observed, when adding more NaHC03. The effect of different MgCla concentrations on enzyme activity was also investigated, and it was found out that specific enzyme activity had reached the maximum level, with addition of 15mM MgCla. The effect of the base added to the incubation condition was investigated and maximum activity was measured with Tris HC1 base at pH=8.i It was also observed that the enzyme was inhibited at extremely low and high pH's. For the purpose of investigating the effect of heat, the activity was measured at different temperatures. and it was observed that it had reached the maximum point at 37°C, and as was understood via Arrhenius Graph, that the enzyme had a trans i t i on temperature. As a result, It was ascertained that ideal incubation conditions for HC0-3-ATPase was. 20 mM Tris HC1, 2 mM MgCl2, 1 mM Oubain, 20 mM NaHC03/ 3 mM ATP. Kinetic parameters of HCO-3-ATPase were surveyed and M.Menten, Lineweaver-Burk, Eadie Hostee graphs for ATP were presented, comparing and contrasting their Km' s and Vmax's. On the other hand. Hills graphs for ATP were drawn and it was found out that the enzyme had only one bounding space. -92-HC0.3 and MgCla were added, and then M.Menten graph was drawn and kinetic parameters were looked at. Experimental ischemia model suggested by Tamura was applied, and MDA level and enzyme activity in homogenization material obtained were measured. Finally, it was found out that in the ischemia group, enzyme activity of HCO-3-ATPase decreased, compaired to that of the control group and the treatment group seemed to have a higher enzyme activity than the ischemia group. MDA level seemed to increase in the ischemia group, and to decrease in the teratment group. -93-