Pankreas langerhans adacık hücrelerinde kalsiyum adenozin 5` trifosfataz enzim düzeylerinin deneysel diyabetik sıçan modelinde araştırılması

Abstract

6. ÖZ Bu çalışma STZ ile deneysel diyabet oluşturulan sıçanların pankreas Langerhans adacık hücrelerinde Ca++ ATPaz enziminin incelenmesi amacı ile yapılmıştır. Deneylerimizde Ç.Ü. Deneysel Cerrahi ve Araştırma Merkezinden temin edilen Wistar türü dişi ve erkek sıçanlar kullanılmıştır. Birinci aşamada deneysel diyabet modeli oluşturulmuştur. Bu amaç için sıçanlara kg başına 65 mg STZ verilmiştir. Kontrol ve diyabet grubu sıçanların kan glukoz, idrar glukoz, günlük su alımları ve idrar atılımları ölçülmüştür. Ayrıca kontrol ve diyabet grubu sıçanlara ait ağırlık değişimleri izlenmiştir. Diyabet modelinin oluşturulmasına ait ışık mikroskobik ve histolojik incelemeler Ç.Ü. Patoloji Anabilim Dalı tarafından yapılmıştır. Kontrol grubu sıçanların kan ve idrar glukoz düzeylerinde deney süresince bir fark saptanmamıştır. Diyabet grubu sıçanlarda ise STZ enjeksiyonundan sonra kan ve idrar glukoz düzeylerinde anlamlı bir artış olduğu saptanmıştır. Her iki gruba ait sıçanların yem ve su alımlarında bir fark gözlenmemiştir. Diyabet grubu sıçanların günlük idrar atılımlarında kontrol grubuna göre anlamlı bir şekilde artış saptanmıştır. Kontrol grubu ve diyabet grubu sıçanların ağırlık değişimleri izlenmiştir. Diyabet grubu sıçanlar kontrol grubu sıçanlara oranla daha az ağırlık kazanmıştır. Diyabet grubu sıçanlara ait pankreas dokusunun ışık mikroskobik incelemesinde pankreas Langerhans adacık hücrelerinde sayıca azalma görülmüştür. Çalışmanın ikinci aşamasında sıçanların pankreas Langerhans adacıkları her pankreas için 7 mg kollogenaz ilave edilmek suretiyle izole edilmiştir. Adacıklar mikroskop altında sayılarak tek tek toplanmıştır. Çalışmanın üçüncü aşamasında adacık hücrelerinden kalsiyum adenozin 5'-trifosfataz enzimi saflaştınlmıştır. Bu amaç için differansiyel santrifügasyon uygulanarak mikrozom fraksiyonu izole edilmiştir. Differansiyel santrifügasyon sırasında elde edilen nükleus, mitokondri, granül ve mikrozom fraksiyonlarında enzimin spesifik aktivitesi ölçülmüş ve en yüksek enzim aktivitesi mikrozom fraksiyonunda bulunmuştur. Mikrozom fraksiyon enzimin saklama koşullan ve enzimin kinetik çalışmaları için kullanılmıştır. Enzim için en uygun saklama koşulunu saptamak amacı izole edilen pankreas Langerhans adacık hücreleri ve saflaştırılmış enzim oda ısısında, -4 °C, + 4 °C ve - 70 70°C 'de bir ay saklanmış ve her hafta enzimin spesifik aktivitesi ölçülmüştür. Oda ısısında bir hafta sonra enzim aktivitesi ölçülememiştir. Enzim aktivitesi başlangıçta 6.2 /xmol Pi/mg protein/saat, - 20 °C 'de bir ay sonra 5.2 /xmol Pi/mg protein/saat, -70 °C 'de bir ay sonra 5,6 jumol Pi/mg protein/saat olarak bulunmuştur. Çalışmamızın bir diğer aşamasında glukoz, kalsiyum, magnezyum, EDTA ve adenozin 5'-trifosfat 'in çeşitli derişimlerinin Ca++ ATPaz enziminin spesifik aktivitesi üzerine etkisi in vitro olarak incelenmiştir. Ortamda hiç glukoz bulunmaz iken Ca++ ATPaz enzimine ait spesifik aktivite 5,9+0,34 /*mol/Pi/mg protein/saat iken 16 mM glukoz konsantrasyonunda enzimin spesifik aktivitesi 1,10+0,05 /imol Pi/mg protein/saat olarak bulunmuştur. Ca++ ATPaz enzimine ait en yüksek spesifik aktivite 0,15 mM Ca++, 6 mM Mg++, 0,1 mM EDTA, 3 mM adenozin trifosfat varlığında bulunmuştur. Ayrıca çalışmalarımızı tamamlayıcı olarak kontrol ve diyabet grubu sıçanlara ait lipid peroksidasyonu ürünü olan malondialdehit ve alfa tokoferol düzeyleri ölçülmüştür. Diyabet grubu sıçanlara ait malondialdehit düzeyleri kontrol grubu ile karşılaştırıldığında istatiksel açıdan anlamlı olarak artmıştır. Alfa tokoferol düzeyleri ise diyabet grubunda istatiksel olarak anlamlı bir şekilde azalmış olarak bulunmuştur. Çalışmamızda elde ettiğimiz sonuçlarımıza göre artan lipid peroksidasyonu zar yapısının ve bütünlüğünün bozulmasına artmış glukoz derişimi ise hücre zarlarında fosfolipid turnoveri lipid tabakası ve yağ asidi kompozisyonunda değişimlere neden olarak Ca++ ATPaz enzimini inhibe ettiği sonucuna varılmıştır. Anahtar ketimeter: Streptozozın., dıybettk sıçan, pankreas, Ca++ATPaz. 71

7. ABSTRACT This study was carried out to determine Ca+2 ATPase activity in pancreatic islet cells of streptozocin (STZ) induced diabetic rats. Wistar rats of both sexes, which were kindly provided by Experimental Surgery Research Center of Çukurova University, were ased in the experriments. In the first step, experimental diabetes was induced. With this purpose, rats were given 65 mg/kg STZ. Blood and urine glucose levels daily water consumption, urinary outputs and changes in body weights measured in control and test groups. Pathological examinations were performed at pathology department of Çukurova University. Blood glucose levels were 104+9 and 407+41 mg/dl in the control and diabetic rats, respectively. Pellet and water consumption were significantly different between both groups. Urinary glucose level was estimated as 0,064+0,07 in the controls where as it increased to 5,6+0,82 mg/day in the diabetic rats. Urinary output also increased in diabetic rats (9,5 ±1,3 ml/day and 17,5 ±1,40 ml/day for the controls and diabetics, respectively). Diabetic rats gained weight less than the controls did. In diabetic rats, histopathological examination revealed reduction in islet cell number, and thickening of basal membrane 4 weeks after administration of STZ. In the second step, pancreatic islets were purified by addition of 7 mg collagenase oud collected under light-microspose. In the third step, adenosin triphosphatase was purified from islets cells. Microsomal fraction was isolated by differential centrifugation following which spesific enzyme activity was determined in various fractions such as nucleus, mitochondria, granule microsomes. The highest enzyme activity was retained in the microsomal fraction. For this reason, the conditions for preserving the enzyme kinetics were investigated in microsomal fraction. To determine the optimal conditions for storing the enzyme, isolated islet cells the enzyme purified from islet cells were kept at room temperature, - 4 °C, + 4 °C and - 70 °C for 1 month. Specific activity of the enzyme was measured every week. No activity was found after keeping the samples at room temperature. Enzyme activity was 6,2 fimol Pi/mg protein/hour initially, 5,2 /xmdl Pi/mg protein/hour and 5,6 fimol 72Pi/mg protein/hour later keeping at - 75 and - 20 °C respectively. In the fourth stop in vitro Ca+2 ATPase activity was measured in various concentrations of glucose, calcium, magnesium, EDTA, ATP. Ca-ATPase activity was 5,9+0,34 in glucose lacking-medium. When glucose concentration was raised to 16 mM, Ca ATPase activity fell to 1,1+0,05 ^mol Pi/ml prot./ hours. The highest enzyme activity was found in the presence of 0,15 mMol Ca+2, 6 mMol Mg+2 0,1 mMol EDTA, 3 mM ATP. Furthermore, we also measured blood levels a-tokoferol and malondialdehyde (MDA), an end-product of lipid peroxidation. MDA levels increased and a-tokoferol levels decreased significant in the test group its compared with the control groups. According to our results, enhanced lipid peroxidation may impair membrane structure and integrity. Increase in glucose concentration may alter phospholipid turn-over as weel as fatty acid composition of the membrane and thus inhibit Ca+2 ATPase activity. Key words: Streptezotocin, diabetic rats, pancreas, Ca++ATPase 73