Çukurova bölgesinde saptanan glukoz-6-fosfat dehidrogenaz enzim varyantlarının phage display yöntemiyle tanımlanması

Abstract

ÖZET Çukurova Bölgesinde Saptanan G-6-PD Varyantlarının Phage Display Yöntemiyle Tanımlanması Glukoz-6-Fosfat Dehidrogenaz (G6PD) vücudun tüm hücrelerinde bulunan önemli bir enzimdir. G6PD hücrede gerekli bir indirgeyici güç kaynağına sahip olmasından dolayı housekeeping bir enzim olarak düşünülmektedir ve eritrositlerde G6PD pentoz fosfat yolunda ilk ve hız sınırlayıcı enzimdir. G6PD eksikliği bilmen en yaygın kalıtsal enzim defektidir ve dünya üzerinde 400 milyondan fazla insanı etkilemektedir. Dünya Sağlık Örgütünün (WHO) biyokimyasal, kinetik ve klinik kriterlerine göre 442 farklı G6PD varyantı tanımlanmıştır. Yapılan tarama çalışmaları sonucunda Çukurova bölgesinde enzim eksikliğinin %8,2 oranmda olduğu rapor edilmiştir. Yapılan bu çalışmada, phage display tekniğinden yararlanarak scFv formunda insan G6PD enzimini algılayabilen rekombinant antikor parçası elde edilmiştir. ScFv kütüphanesinin hazırlanmasında Balb/cJ soyuna ait fareler, kolon kromatografisi ile kısmi olarak saflaştırılmış G6PD enzimi ile bağışıklanmıştır. Bağışıklanan farelerin dalaklarından mRNA izole edilmiş ve immünglobulin değişken ağır ve hafif zincir genlerini içeren cDNA'yı elde etmek için kullanılmıştır. Ağır ve hafif zincir genleri PCR ile çoğaltılmıştır. İmmünglobulin ağır ve hafif zincir değişken bölgeleri sentetik bir linker yardımıyla PCR işlemiyle ve pCANTAB5E fajmit vektörüne klonlanmıştır. 3 defa uygulanan biopanning işlemi sonrasmda rastgele seçilen 20 klon insan G6PD enzimine karşı faj ELİZA yöntemiyle taranmış ve bu klonlardan iki tanesinin G6PD enzimini tanıdığı tespit edilmiştir. Anahtar Sözcükler: Fajmit vektör, G6PD, İmmünglobulin, Phage display, ScFv, XII

ABSTRACT Determination of the G-6-PD Variants Detected in Çukurova Region by Using Phage Display Technique GIucose-6-phosphate dehydrogenase is a ubiquitous enzyme that is found in all cells of the body. G6PD is often considered to be a housekeeping enzyme because it is an essential source of reducing power within the cell. In erythrocytes, G6PD is the first and rate limiting enzyme in the hexose monophosphate shunt Deficiency of G6PD is the most common inherited enzyme defect known, affecting more than 400 million people worldwide. 442 different G6PD variants have been described based on World Health Organization (WHO) criteria for biochemical, enzymatic and clinical characteristics. The incidence of G6PD deficiency is reported as 8,2% according to the population surveys done in Çukurova region of Turkey. In this study, by using phage display tecnique in the single chain variable fragment (scFv) form recombinant antibody fragment that perceive human G6PD enzyme was obtained. For the construction of scFv library, mice which are Balb/cJ race were immunized with G6PD enzyme that purified partially using colon chromatography. The mRNA is extracted from mice spleen and used to obtain cDNA containing the genes for the variable heavy and light chains. These genes were amplified by using PCR. After amplification immunglobulin heavy and light chain is linked together with a synthetic linker through a PCR assembly process and these assembled genes are cloned into pCANTAB5E phagemid vector. After three biopanning process randomly selected 20 colony against human G6PD enzyme were screened with phage ELISA method and two colony from these colonies that recognize G6PD enzyme were established. Key Words: G6PD, Immunoglobulin, Phage display, Phagemid vector, ScFv xm