Biyolojik örneklerde kolay uygulanabilir, enzimatik inozitol tayin yönteminin geliştirilmesi

Abstract

ÖZET Biyolojik Örneklerde Kolay Uygulanabilir Enzimatik Inozitol Tayin Yönteminin Geliştirilmesi İnozitol siklik hekzitol yapıda bir biyomolekül olup birçok organizmanın `ubiquitous` hücresel bileşenidir. İnozitolün biyolojik olarak aktif formu olan myoinozitol (MI) dokularda serbest olarak veya fosfolipitlerle kompleks yapmış şekilde bulunabilir. Bu komplekslere fosfatidilinozitoller (Pl) adı verilir. PPlar hücredeki en önemli işlevlerini, ikinci haberci sisteminde gösterirler. Serbest halde bulunan MI ise diyabet ve SSS hastalıklarının patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. Bu proje kapsamında, biyolojik örneklerdeki MI miktannı ölçmek amacıyla hassas, kolay uygulanabilir bir enzimatik yöntem geliştirilmeye çalışılmıştır. Deneyin prensibi, NAO varlığında MIDH enziminin myoinozitol' ü myoinozoz' a dönüştürmesi sırasında oluşan NADH'nin 340 nm'de, 37 °C'de 5 dakika boyunca verdiği absorbansın ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Myoinozitolün standart eğrisi 0-100 p.grnıL arasında lineer bulunmuştur. _ eneyin kalite kontrol çalışmaları içerisinde MI düzeyi önceden belirlenmiş bir serum örneği üzerine farklı derişimlerde MI eklenerek analitik geri elde %99,8 olarak hesaplanmıştır. Biyolojik sıvılarda yöntemin duyarlılığını arttırmak için deproteinizasyon, nötralizasyon ve glukozdan arındırma aşamalan uygulanarak ön analitik çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucu bu iki aşamanın da kullanılmasına gereksinim olmadığı, yöntemin glukoz (250 mg/dL' ye kadar) ve protein ile interferons vermediği saptanmıştır. Yöntemin tekrarlanabildiği yaklaşık olarak %4,5(CV) bulunmuştur. Kan MI düzeylerini ölçmek için, serum ve plazma örnekleri kullanılmış, koşullarımızda en iyi örnekleme şeklinin serum olduğu gözlenmiştir. Daha sonraki aşamalarda, serum MI konsantrasyonu 40 sağlıklı bireyde ölçülmüş ve normal populasyon serum MI düzeyi ortalama ve standart sapması 10,0912,35 ng/mL olarak bulunmuştur. Cinsiyet ve yaş durumuna göre serum MI düzeyleri arasında anlamlı farklılık bulunamamıştır. Dört farklı yaş grubu ile çalışılmıştır. Yaş 0-15, 16-30, 31-45 ve 45 üstü olarak gruplandınlmıştır. Bu yaş gruplarına göre serum MI düzeyinin ortalama ve standart sapması (X±SD) sırasıyla, 11,06±3,43; 12,11±1,55; 10,48±1,97 ve 9,77±1,59 ng/mL olarak bulunmuştur. Serum MI düzeyi X±SD kadınlarda 10,96*1,76 ng/mL iken erkeklerde 10,82±2,96 ng/mL olarak saptanmıştır. On diyabetik bireyde yapılan çalışmalarda serum MI düzeyinin kontrol grubuna göre düşük olduğu izlenmiştir (X±SD - 5,22±1,03 ng/mL). Aynca farklı bir biyolojik sıvı örneği olarak 10 amnion sıvısında çalışmalar yapılmış, amnion sıvısının serumdan daha yüksek MI düzeyine sahip olduğu gösterilmiştir(X±SD = 20,53±5,90 /ıglmL) Geliştirdiğimiz yeni yöntemin bu verilerine göre, hassas olduğu ve serum ile amnion sıvısında MPnın kantitatif ölçümü için kullanılabileceği ortaya konulmuştur. Anahtar Sözcükler: Amnion sıvısı, Enzimatik yöntem, Myoinozitol, Serum XIII

ABSTRACT Development of an Available Enzymatic Method for the Measurement of Inositol in Biological Samples Inositol, whose structure is cyclic hexitol, is a `ubiquitous` cellular component of many organisms. Myoinositol (Ml), which is the biological active form of inositol, is found as free form and complex with phospholipids in tissues. These complexes are called phosphatidylinositols (PI). PI show their the most important actions in cell, in second messenger system. Ml, which is the free form of inositol, acts an important role at the pathogenesis of diabetes and central nervous system (CNS) diseases. In this project, a sensitive, an available enzymatic method has been developed for the quantitation of myoinositol in biological samples. The method involves use of NAD and myoinositol dehydrogenase (MIDH), oxidation of myoinositol to myoinosose and measurement of the increase in absorbance at 340 nm of NADH for 5 minutes at 37 °C. The calibration curve for myoinositol was linear between 0 - 100 jig/mL. In studies of quality control for this method, analytical recoveries of myoinositol added to serum whose Ml concentration is known, was 99.8%, respectively. The steps which are deproteinlzatlon, neutralization and glucose removal was applied to enhance the sensitivity of the method in biological fluids. As a result of our experiments, this method doesn't interfere with glucose (250 mg/dL) and protein. Within - run coefficient of variation (CV) was 4.5%, respectively. This method is applied in serum and plasma to measure blood Ml concentration, the best specimen is determined as serum in our conditions. In this study, serum Ml concentration was assayed in 40 healthy individuals serum Ml concentration was found 10.09 ± 2.35 ug/mL. It was not found significant differences between serum Ml concentration and sex, age (P>0.05). As a result of our study with four different age groups, serum Ml concentration was found for 0-15 age ( X ± SD ) 11.06 ± 3.43; for 16-30 age 12.11 ± 1.55; for 31-45 age 10.48 ±1.97 and for 45 and over age 9.77 ± 1.59 ug/mL. Mean serum Ml concentration was found 10.90 ± 1.76 for women; 10.82 1 2.96 ug/mL for men. We measured serum Ml concentration in 10 diabetic patients, serum Ml concentration of diabetics was found too low to compare with controls (X ± SD = 5.22 ± 1.03 ug/mL). We studied ten amnion fluid as a different biological fluid by this method. It is demonstrated that the Ml level of the amnion fluid was higher than in serum ( X ± SD = 20,5315,90 ug/mL). This new method which we have been developed simple, sensitive and enables quantitative analysis of myoinositol in serum and amnion fluid. Key words: Amnion fluid, Enzymatic method, Myoinositol, Serum XIV