Fare Lizozim ve İnterlökin-2 Genlerinin Klonlanması ve Malign Melanomada Anti-tümöral DNA Aşısı Olarak Kullanılması

Abstract

ABSTRACTCloning of Mouse Lysozyme and Interleukin-2 Genes and Using asAnti-tumoral DNA Vaccine in Malign MelanomaAli İrfan GÜZELImmunocompetent hosts can potentially recognize malignancies andimpede their proliferation by killing them. However, any failure of the immunesystem due to the lack of tumor immunogenicity or a tumor inducedimmunosuppressive environment causes malignant cells to escape from theimmune detection. One goal of tumor immunotherapy is to manipulate the hostimmune response to the malignancies to allow for the recognition andelimination of them.The aim of this study is to clone mouse interleukin-2 (IL-2) and lysozymegenes to pHM6 mammalian expression vector and use them in B-16V melanomacells for the purpose of immunotherapy. In different studies made previously, IL-2 has been used both in the form of DNA vaccine and peptide, but lysozyme onlyin the peptide form. The lysozyme, known to have anti-tumoral andimmunomodulatory as well as antibacterial activities was investigated first timehere in the form of DNA vaccine.For this purpose, four experiments were made to evaluate the anti-tumorigenic effects of lysozyme and interleukin-2 genes when used in vaccineform. 1) Plasmids combined with mouse IL-2 and lysozyme genes (pHM6mIL-2and pHM6mLys) were injected in the form of DNA - liposome complex into thetumor mass formed by the injection of B-16V melanoma cells into mice (inbredC57BL/6) subcutaneously. 2) Recombinant plasmids were injected into micesubcutaneously two days before the injection of B-16V cells to the same site. 3)B-16V tumor cells transfected with recombinant plasmids (B-16VpHM6mIL-2 andB-16VpHM6mLys) were injected subcutaneously to the mice. 4) Tumor free miceof the assay 3 were challenged with B-16V melanoma cells.Overall 277 mice were used in 15 groups of four experiments. The resultsof experiments 1 and 2 showed that the injection of recombinant plasmidscarrying IL-2 and lysozyme genes either before or later the tumor developmentdid not significantly retard the progress. However, in experiment 3, the micewere remained tumor free in a ratio of %32 for B-16VpHM6mIL-2, %51.7 for B-16VpHM6mLys and %49.2 for B-16VpHM6mLys + B-16VpHM6mIL-2. There was notumor development in the mice living after experiment 3 treatments when B-16cells were re-injected (experiment 4) indicated that a protective immunity wasarisen. These results had showed that, lysozyme can also be used in the tumorimmunotherapy if it be secreted in tumor cells in a high level through an agentsuch as plasmid DNA.Key Words: B-16V, C57BL/6, DNA Vaccine, IL-2, Lysozyme, pHM6 plasmid vector,Tumor immunotherapy

ÖZETFare Lizozim ve İnterlökin-2 Genlerinin Klonlanması ve MalignMelanomada Anti-tümöral DNA Aşısı Olarak KullanılmasıAli İrfan GÜZELİmmünokompetent konakçılar potansiyel olarak anormal hücreleritanıyabilmekte ve onları öldürerek çoğalmalarını engellemektedir. Fakat, tümörimmünojenitesindeki zayıflık veya tümör tarafından indüklenen immüniteyi baskılayıcıçevreden kaynaklanan savunma sistemindeki bozukluklar anormal hücrelerin immüntaramadan kurtulmasına neden olurlar. İmmünotedavinin hedeflerinden biri, konakçıimmün yanıtlarını anormal hücreleri tanıyabilecek ve onları yok edecek şekildemanipüle etmektir.Bu tez çalışmasının amacı: fare interlökin-2 (IL-2) ve lizozim genlerini pHM6memeli ekspresyon vektörüne klonlamak ve B-16V melanoma hücrelerindeimmünotedavi maksadıyla kullanmaktır. Daha önce yapılan değişik çalışmalarda, IL-2hem protein hem de DNA aşısı formunda, lizozim ise yalnızca protein formundakullanılmıştır. Anti-bakteriyel aktivite yanında anti-tümör ve immünomodülatör etkilerede sahip olduğu bilinen lizozim ilk defa bu çalışmada DNA aşısı formundakullanılmıştır.Lizozim ve IL-2 genlerinin DNA aşısı formunda kullanılmaları durumundaoluşturacakları anti-tümörijenik etkiyi değerlendirmek için dört değişik denemeyapılmıştır; 1) farelerin (inbred C57BL/6) deri altında B-16V melanoma hücreleriyleoluşturulmuş olan tümör kitleleri içine, IL-2 ve Lys genleri klonlanmış olanrekombinant pHM6 plazmitleri (pHM6mIL-2 ve pHM6mLys) lipozomla kompleksoluşturularak enjekte edilmiştir. 2) B-16V hücrelerinin enjeksiyonundan iki gün önceaynı bölgeye, rekombinant plazmit-lipozom kompleksleri farelerin deri altına enjekteedilmiştir. 3) Rekombinant plazmit vektörlerin B-16V hücrelerine in vitrotransfeksiyonu sonucu geliştirilmiş olan transfekte tümör hücreleri (B-16VpHM6mIL-2ve B-16VpHM6mLys) farelerin deri altına enjekte edilmiştir. 4) Deneme 3?ün tümörgeliştirmeyen farelerine B-16V hücreleri tekrar enjekte edilmiştir.Dört denemenin 15 grubunda toplam 277 fare kullanılmıştır. deneme 1 ve 2?ninsonuçları göstermiştir ki tümör oluşmadan önce veya sonra IL-2 ve lizozim genlerinitaşıyan plazmitlerin enjeksiyonu tümör büyümesini önemli derecedeyavaşlatamamıştır. Fakat, deneme 3?de, fareler B-16VpHM6mIL-2 için %32, B-16VpHM6mLys için %51.7, B-16VpHM6mLys + B-16VpHM6mIL-2 için ise %49.2oranında tümör geliştirmemiştir. Deneme 3?deki uygulamadan sonra yaşayan fareleretekrar B-16V hücresi enjekte edildiğinde (4. uygulama) sağ kalan farelerin hiçbirindetümör oluşmaması koruyucu immünite geliştiğine işaret etmektedir. Bu sonuçlar,plazmit DNA gibi bir ajan aracılığı ile tümör hücrelerinde yüksek düzeyde salgılatılmasıdurumunda, lizozimin de tümör immünotedavisinde kullanılabileceğini göstermektedir.Anahtar Sözcükler: B-16V, C57BL/6, DNA Aşısı, IL-2, Lizozim, pHM6 plazmitvektörü, Tümör immünotedavisi