3D paper based analytical microfluidic chip for earlier molecular diagnosis of cervical cancer at the point of care

Abstract

Bu çalışmada, serviks kanserinin etiyolojik ajanı insan papiloma virüsü (HPV) 18 ve16'nın ekstraksiyonu, enzimsiz amplifikasyonu ve teşhisi için nokta analizlerinde(POC) kullanılan kağıt tabanlı analitik mikroakışkan çip geliştirilmiştir.Bu tez çalışmasının sonucu olarak serviks kanserinin moleküler düzeyde erkenteşhisini sağlayacak yeni bir nokta analiz (POC) ekstraksiyon ve teşhis cihazı eldeedilmiştir. Analitik tayin çipinde enzimsiz amplifikasyona olanak veren, manyetikmikroboncuk ve gümüş nano parçacıklı primerler aracılığı ile özel bir modifikasyontekniği kulanılmıştır. Bu düşük maliyetli POC cihaz 30 dakika içerisinde HPV DNAsını çok düşük tayin değerlerini teşhis ederek, doktorun hastasını aynı ziyarette hemteşhis edip hem de tavsiye ve tedavisine başlamasını sağlamaktadır. Bu cihaz HPVnin gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde kolayca tayininin yapılabilmesi için çokbüyük bir avantaj sağlamaktadır.Burada, ayrıca kombine HPV formu için bir ekstraksiyon malzemesi ve onunkimyasal tek basamak kullanımlı tampon çözeltisi geliştirilmiştir. Bu ekstraksiyonmalzemesinin mikroakışkan çipde kullanımı için tayin öncesinde akış hızları vezamanları ayarlanmıştır. Prensip olarak bu kağıt ekstraksiyon malzemesi servikshücrelerinin lizisi ile HPV ekstraksiyonu sonucu DNA salınımını sağlamaktadır.Elde edilen bu DNA, hedef analitin amplifikasyonu ve teşhisi için, tiyol bağlı gümüşnano parçacıklar ve streptavidin kaplı manyetik mikro boncuklarla modifiyeedilmiştir. Kağıt tabanlı mikroakışkan cihazı elde etmek için uygulanan tümaşamaların dizaynı yapılmış ve optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Son olarak waxyazıcı ve boşluk kanallar kullanılarak dizayn edilen kağıt tabanlı mikroakışkan tayinplatformunun üretimi yapılmıştır. Mikroakışkan kağıt tabanlı analitik çip üretimindekalıpla basılmış grafit elektrot, kalem ucu grafit elektrot ile grafen ve grafenoksitmodifiye elektrot formları kullanılmıştır. Son olarak da kağıt cihaz 3 boyutluformuna ulaştırılmak için katlanarak birleştirilmiştir.Geleneksel olarak, mikroakışkan cihazlar HPV DNA sının, polimer zincir reaksiyonuile amplifikasyonu ve tayini için, enzim gerektirmektedir. Şu ana kadar literatürde,gelişmekte olan ve gelişmiş ülkeler için kritik rol oynayan serviks kanserinin erkenteşhisi için, ekstraksiyon ve tayin ünitesinin tamamını içeren enzimsiz kağıt tabanlıbir POC cihaz rapor edilmemiştir.Anahtar Kelimeler: Mikroakışkan, Nokta analiz cihazları (POC), Kağıt tabanlıanalitik çip, İnsan Papiloma Virüsü (HPV), Serviks Kanseri, Moleküler teşhis

In this study, a point of care (POC) paper based analytical microfluidic chip isdeveloped for extraction, non-enzymatic amplification, and detection of combinedhuman papillomavirus (HPV) 18&16, the etiological agent of cervical cancer. Thisdevice includes both paper extraction support material and paper based detectiontool.As a result of this thesis, we obtained a novel point of care extraction and detectiontool for earlier molecular diognasis of cervical cancer. A special modificationtechnique has been used to allow non-enzymatic amplification in our analyticaldetection chip by using magnetic micro beads and silver nanoparticles labeledprimers. The low cost point of care device allows doctors to diagnose, advise, andtreat the patients all within the same visit, and the entire process can be completed inless than 30 minutes for low limit of detection (LOD) value of HPV. It is a beneficialtool for detection of HPV positive patients in both low resource settings anddeveloped countries.Herein, also an extraction tool and its chemical single step buffer have beendeveloped for combined HPV form. Their flow rates and times were adjusted inorder to use in microfluidic chip prior to detection. Principally, cervical cells lysed toextract HPV for releasing DNA via paper support material. Then, DNA has beenmodified with thiol labeled silver nanoparticles and streptavidin coated magneticmicrobeads for amplification, and detection of the target analyte. All of the steps areoptimized, and designed in order to achieve paper microfluidic device. Finally, apaper based microfluidic detection platform was fabricated using wax printer andhallow channels in its design. Microfluidic paper analytic chip had also fabricated asincluded stencil printed, pencil lead, graphene, and graphene oxide modifiedelectrodes forms. Then, the paper device assembled its 3D form as folding it.Traditionally, microfluidic devices require enzymes for amplification and detectionof HPV DNA in polymerase chain reaction (PCR). There is not wholly integratednon-enzymatic paper based point of care detection tool reported in the literature forearlier detection of cervical cancer which is very critical for the developed countries.Keywords: Microfluidics, Point of Care (POC) Devices, Paper analytical chip,Human Papilloma Virus (HPV), Cervical Cancer, Molecular diagnosis