Metformin uygulamasının replikatif senesent insan mezenkimal kök hücrelere etkisinin gen ifadesi düzeyinde incelenmesi

Abstract

Mezenkimal kök hücreler (MKH), kendini yenileme potansiyeli ve immün modülatör özelliği sebebi ile törepatik etkiye sahiptirler. MKH'lerin törepatik amaçlı kullanılabilmeleri için in vitro olarak çoğaltılmaları gerekliliği vardır ve bu durum senesens sebebi ile kısıtlanmaktadır. Senesens hücre bölünmesini durduran, ancak hücrelerin metabolik aktivitelerinin devam ettiği dejeneratif bir süreçtir. Metformin; glukoz, insülin ve IGF-1 seviyesini düşüren, Tip 2 diyabette sıklıkla kullanılan etken bir maddedir. Metforminin etki mekanizması senesens mekanizmasında önemli yeri olan IGF (insülin benzeri büyüme faktörü) sinyal yolağı ile yakından ilişkilidir. Bu sebeple bu tez çalışmasında metformin uygulamasının senesens sürecini geciktireceği düşünülerek kültür ortamında replikatif senesens sürecine sokulan MKH'lere eş zamanlı olarak çeşitli dozlarda metformin uygulaması yapılmıştır. Kontrol grubu hücrelere ve metformin uygulanan hücrelere kültürün 14., 21. ve 28. günlerinde senesens ilişkili β-galaktozidaz testi, hücre döngüsü testi ve RT- qPCR çalışması yapılmıştır. RT-qPCR çalışmalarında senesens süreci ile yakından ilişkili stemness genleri ve DNA tamir yolağı ile ilişkili çeşitli genlerin ekspresyon seviyelerindeki değişimler incelenmiştir. Senesens ilişkili β-galaktozidaz testi ve hücre döngüsü testi sonuçları metformin uygulamasının MKH'lerin senesens sürecini özellikle 28. gün 6 mM ve 9 mM grubunda geciktirdiğini göstermiştir. Metformin uygulamasının kültürün geç safhalarında senesent hücre oranını azalttığı, hücre döngüsü testinde ise hücreleri G0/G1 fazından S fazına geçişini sağladığı gözlenmiştir. Ayrıca stemnes genlerinden hücre döngüsünün G1- S faz geçişini sağlayan KLF4 geni ekspresyon seviyesinin kültürün geç safhasında artması (28. gün 9 mM dozda) da hücre döngüsü testi bulgusunu desteklemiştir. Anahtar Kelimeler: Metformin, gen ekspresyonu, mezenkimal kök hücre, senesens.

Mesenchymal stem cells (MSC) have therapeutic effect due to their self-renewal potential anda ımmun modulator effect. MSCs need to be replicated in vitro in order to be used for therapeutic purposes, and this is restricted by the cause of senescence. Senescence is a degenerative process that arrast cell division but continues the metabolic activities of the cells. Metformin is an active ingredient which is decrase glucose, insulin and IGF-1 levels and frequently used in Type 2 diabetes. The mechanism of action of metformin is closely related to the insulin-like growth factor (IGF) signaling pathway, which plays an important role in the senescence mechanism. In this manner, we hypothesis that treatment with metformin would delay the senescence. Metformin was administered at various doses on ongoing culture of MSCs. Control group and the metformin treated group were subjected to senescence-related β-galactosidase test, cell cycle test and RT-qPCR test on days 14, 21 and 28 of the culture. Alterations in gene expression of stemness and DNA damage repair (DDR) genes to the related with senescence process were investigated by using RT-qPCR. Results of senescence-related β-galactosidase test and cell cycle test showed that metformin treatment delayed the senescence process of MSCs. It has been observed that 6 mM and 9 mM metformin treatment reduced the senescent cell ratio in the late cultures. In the cell cycle test, it was observed that, metformin provided the transition of the cells from the G0 / G1 phase to the S phase. In addition, the increase in the late phase of the expression of KLF4 gene, which is one of the stemness genes, which provides G1-S phase transition of the cell cycle( 9 mM dose,day 28) supports the findings.Key Words: Metformin, gene expression, mesenchymal stem cell, senescence.