Alabalıklarda bakteriyel balık patojenlerinin teşhisinde yeni izolasyon ve identifikasyon yöntemlerinin uygulanması

Abstract

Dünyada kültür balıkçılığına olan talebin artmasıyla birlikte su ürünleri sektörü de büyümekte, buna bağlı olarak karşılaşılan problemler de artmaktadır. Bakteriyel balık hastalıklarının sebep olduğu ölümler, balık çiftliklerinde ciddi ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Etken patojenin güvenilir şekilde izole edilerek, doğru ve hızlı identifiye edilmesi hastalıkların tedavi edilerek ekonomik kayıpların önüne geçilmesi açısından oldukça önemlidir. Bu araştırmada, Güney Ege Bölgesi'nde bulunan 10 adet gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) çiftliğinde hastalık vakaları tespit edilerek etken patojenler izole edilmiş, biyokimyasal ve moleküler identifikasyon sonuçları doğrultusunda Aeromonas hydrophila, Lactococcus garvieae, Pseudomonas fluorescens, Vibrio anguillarum ve Yersinia ruckeri suşları tanımlanmıştır. Klinik mikrobiyolojide varsayımsal identifikasyonda kullanılan chromID® CPS® Elite / Columbia CNA +5% sheep blood, chromID® CPS® Elite, chromID® S. aureus Elite, chromID® Vibrio ve chromID® MRSA Smart kromojenik besiyerlerinin bakteriyel balık patojenlerinin izolasyonunda kullanılabilirliği ilk kez denenmiş, bu yeni besiyerlerinin etken patojenlerin tespitinde uygulanabilirliği değerlendirilmiştir. Bakterilerin ribozomal protein fraksiyonlarının belirlenmesine dayanan bir tanımlama yöntemi olan MALDI-TOF teknolojisi ile tanımlama yapan VITEK MS de bakteriyel balık patojenlerinin identifikasyonunda ülkemizde ilk kez denenmiştir. Ayrıca izole edilen bakteriyel balık patojenlerinin Raman spektroskopisi ile anlamlı spektrumları ilk kez belirlenmiştir. chromID® CPS® Elite'in L. garvieae, chromID® Vibrio'nun ise V. anguillarum'un izolasyonunda farklı koloni renkleri ile ayırt edici olduğu belirlenmiş, kullanıma uygun bulunmuştur. MALDI-TOF teknolojisine sahip VITEK MS ile A. hydrophila, L. garvieae, P. fluorescens, V. anguillarum ve Y. ruckeri % 99,9 başarı oranı ile tanımlanmıştır. Ayrıca tanımlı bakterilerin Raman spektrumlarında polisakkarit, nükleik asit, aminoasit ve yağ asitlerinin band bölgelerinde identifikasyonda ayırt edici olacak farklılıklar belirlenmiş, bu metotla bakterilerin tanımlanmasında kullanılabilecek ilk veriler elde edilmiştir. Mikrobiyolojide rutin olarak kullanılan biyokimyasal ve moleküler yöntemlere alternatif olarak ilk kez uygulanan kütle ve titreşimsel spektroskopik metotların, balıklarda hastalığa neden olan bakteriyel patojenlerin alternatif ve güvenilir teşhisinde kullanılabileceği ortaya konmaya çalışılmıştır.

The aquaculture industry has seen significant development through the demand for farmed fish, therefore, the problems have also been increasing. Mortality caused by bacterial fish diseases causes serious economic losses in fish farms. Reliable isolation of the causative pathogen, accurate and rapid identification are very important steps in terms of preventing economic losses by treating diseases. In this study, the diseased fish were determined from 10 different rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) farms in South Aegean Region, the causative pathogens were isolated and according to biochemical and molecular identification results Aeromonas hydrophila, Lactococcus garvieae, Pseudomonas fluorescens, Vibrio anguillarum, and Yersinia ruckeri were identified. The chromID® CPS® Elite / Columbia CNA +5% sheep blood, chromID® CPS® Elite, chromID® S. aureus Elite, chromID® Vibrio and chromID® MRSA Smart chromogenic mediums which were used in clinical microbiology for presumptive identification of pathogens were tested for bacterial fish pathogens for the first time and the utility of these new media for the detection of causative pathogen was evaluated. VITEK MS, which is an identification method based on the determination of ribosomal protein fractions of bacteria with MALDI-TOF technology, has been tested for the first time in our country in the identification of bacterial fish pathogens Also, significant spectra of isolated bacterial fish pathogens were determined by Raman spectroscopy for the first time. The chromID® CPS® Elite was distinguished by different colors of the L. garvieae colonies when V. anguillarum was determined with different colony appearances in chromID® Vibrio and these have been found suitable for use. VITEK MS with MALDI-TOF technology identified A. hydrophila, L. garvieae, P. fluorescens, V. anguillarum and Y. ruckeri with a 99.9% success rate. Besides, distinctive differences in polysaccharide, nucleic acid, amino acid and fatty acids in the Raman spectra of identified bacteria were determined and the first data were obtained to use for identification of the bacteria with this method. As an alternative to routine biochemical and molecular methods used in microbiology, mass and vibrational spectroscopic methods can be used for alternative and reliable diagnosis of bacterial fish pathogens which cause disease in fish.