Piliç boyun derisinde listeria monocytogenes prevalansının belirlenerek izolatların karakterizasyonu ve litik bakteriyofajlar ile piliç but gıda modelinde biyokontrolünün araştırılması

Abstract

Bu tez çalışmasında, Şubat 2016 – Ocak 2017 tarihleri arasında iki farklı kanatlı mezbahasından toplanan 120 piliç boyun derisi örneğinden Listeri monocytogenes, 60 mezbaha atık suyu örneğinden ise L. monocytogenes'e litik bakteriyofaj izolasyonu yapılarak, izolatların karakterizasyonlarının yapılması ve en geniş spektrumda litik etki gösteren fajlardan oluşan bir kokteyl ile piliç butlarında L. monocytogenes'in biyokontrolünün araştırılması amaçlanmıştır.Analiz edilen piliç boyun derisi örneklerinin 20'sinden (% 16,7) 31 şüpheli L. monocytogenes kolonisi izole edilerek, izolatlar PCR ile doğrulanmıştır. Multipleks PCR ile yapılan serotiplendirmede izolatların tamamının 1/2a (3a) olduğu tespit edilmiştir. Real Time RT-PCR analizi ile tüm izolatlarda L. monocytogenes'in başlıca virülens genlerinden olan hlyA, actA, inlA, inlB, inlC, inlJ, plcA, plcB, fbpA ve fri genleri tespit edilmiş ve virülens faktörlerinin yüksek düzeyde eksprese edildiği izolatlar genetik potansiyel açısından yüksek virülent olarak tanımlanmıştır. İzolatların DNA parmak izi analizi ve aralarındaki klonal ilişki ERIC-PCR ile belirlenmiş olup, 7 farklı DNA profiline sahip oldukları saptanmıştır. Çalışmada, toplanan 60 mezbaha atık suyu örneğinden L. monocytogenes'e litik etkili 5 listeriyofaj izole edilmiştir. Faj DNA'ları Cla1 ve Sac1 restriksiyon enzimleriyle muamele edilerek aynı DNA profiline sahip oldukları belirlenmiştir. Bu analizler göz önüne alınarak M117, M119 ve M135 kodlu fajlar kokteyl oluşturmak amacıyla seçilmiş ve piliç butlarında L. monocytogenes'in biyokontrolü amacıyla kullanılmıştır. Faj kokteylinin piliç butlarına uygulanmasıyla 4°C muhafazada inkübasyonun 3. saatinde L. monocytogenes sayısında 3,30 log kob/ml'a varan bir redüksiyon sağlanmıştır. Sonuç olarak bu tez çalışmasında, piliç etlerinin L. monocytogenes açısından potansiyel bir risk kaynağı olabileceğinin ortaya konmasının yanı sıra, çalışmada elde edilen 3 fajdan oluşan kokteylin kanatlı mezbahalarında son yıkama ya da soğutma aşamasında piliç karkasları veya parça etlerindeki L. monocytogenes'lerin dekontaminasyonunda uygulanabilir olduğu belirlenmiştir.

In this thesis study, it was aimed to isolate L. monocytogenes from 120 chicken neck samples and to isolate lytic bacteriophages from 60 slaughterhouse wastewater from two different poultry slaughterhouses between February 2016 and January 2017, to characterize the isolates and to investigate the biocontrol of L. monocytogenes in broiler chicken legs with a cocktail consisting of phages that showed the broadest lytic activities. Thirty-one suspected L. monocytogenes colonies were isolated from 20 (16,7 %) chicken neck samples and the isolates were confirmed by PCR. By multiplex PCR, it has been determined that all of the isolates were belonged to serotype 1/2a (3a). Real-time RT-PCR analysis revealed that all the isolates were harbored the major virulence genes of L. monocytogenes (hlyA, actA, inlA, inlB, inlC, inlJ, plcA, plcB, fbpA ve fri) and the isolates which expressed the virulence factors highly were identified as genetic potentially high virulent. DNA fingerprint analysis of the isolates and their clonal relationships were determined by ERIC-PCR and were found to have 7 different DNA profiles. In the study, 5 listeriophages with lytic effect on L. monocytogenes were isolated from 60 slaughterhouse wastewater samples. Phage DNAs were treated with Cla1 and Sac1 restriction enzymes and were found to have the same DNA profiles. Taking these analyzes into consideration, phages encoded as M117, M119 and M135 were selected for the cocktail and used for biocontrol of L. monocytogenes in chicken legs. The application of the phage cocktail on chicken legs achieved a reduction up to 3,30 log cfu/ml in L. monocytogenes count at 3 hours of incubation at 4°C. In conclusion, this study suggests that chicken meat can be a potential risk source for L. monocytogenes, and on the other hand the use of the cocktail which consisted 3 phages obtained from this study can be applicable in chicken slaughter process at final wash or at cooling stage for chicken carcasses, as well as in decontamination of chicken meat parts.