Filamentöz funguslardan antibiyofilm aktivitesine sahip ekstrasellüler polipeptitlerin izolasyonu

Abstract

Mikroorganizmalarda görülmeye başlanan antibiyotiklere direnç, yeni antibiyotik arama çalışmalarını gerekli kılmıştır. Prokaryotik ve ökaryotik canlıların immün sistemlerinin bir parçası olarak sentezlenen antimikrobiyal proteinler (AMP) yeni nesil antibiyotikler olarak karşımıza çıkmaktadır. AMP molekülleri kısa zincirli, genellikle katyonik ve geniş spektrumlu aminoasit dizileridir. Antibiyofilm proteinler (ABP) ise AMP moleküllerinin bir alt grubu olup, biyofilm oluşumunu engelleyen polipeptit dizileridir. Bu tez çalışmasında, literatürde fungal tabanlı ABP molekülü bulunmadığından, topraktan filamentöz fungus izole edilerek, kültür filtratlarında ABP taraması yapılmıştır. İzole edilen toplam 120 izolat içerisinde agar difüzyon, çapraz ekim, radyal inhibisyon ve tripsin/proteinaz K parçalama yöntemleri ile Staphylococcus aureus (ATCC 25923) ve metisilin dirençli S. aureus'a (MRSA) etkili 2 adet AMP molekülü üreten fungus belirlenmiş ve bu funguslardan 1 tanesinin ABP ürettiği bulunmuştur. İndükleme sistemi ile belirlenen, trikloroasetik asit (TCA) yöntemi ile izole edilen ve ultrafiltrasyon yöntemi ile saflaştırılan antibiyofilm aktiviteye sahip polipeptit, SDS-PAGE ve trisin-PAGE ile doğrulanmıştır. ABP molekülü üreten filamentöz fungusun korunmuş (Internal Transcribed Spacer) ITS ve kalmodülin gen bölgeleri polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmış ve Aspergillus tubingensis olduğu belirlenmiştir. S. aureus'a karşı minimum inhibisyon konsantrasyon (MIC) değeri 32 mg/L, minimum biyofilm inhibisyon konsantrasyon (MBIC) değeri ise 2 mg/L olarak belirlenen ABP molekülü, Maldi-TOF/MS ile karakterize edilmiştir. Karakterizasyon sonrasında bu proteinin UniProt veritabanında kayıtlı, karakterize edilmemiş, A0A1L9MXD7_ASPTU kodlu yeni bir protein olduğu bulunmuştur. Sonuç olarak, filamentöz funguslarda ABP'nin varlığı ilk kez gösterilmiştir. Bu ABP molekülünün, S. aureus'un biyofilm kaynaklı enfeksiyonlarında kullanılabilecek potansiyele sahip olduğu belirlenmiştir.

Antibiotic resistance among microorganisms poses a great threat to human health. Since, discovery of new antibiotics is necessarily needed. Antimicrobial polypeptides (AMP), which are synthesized as part of the immune systems of prokaryotic and eukaryotic organisms, are emerging as new generation antibiotics. AMPs are amino acid sequences that are short chain and usually cationic. Antibiofilm peptides (ABP) are a subset of AMPs and are polypeptide sequences that inhibit biofilm formation. In this thesis study, the filamentous fungus was isolated from the soil, and the presence of ABP was detected in culture filtrates of these filamentous fungi. Two AMP-producing fungi were identified against Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and methicillin resistant S. aureus (MRSA) by well diffusing, cross streak, radial inhibition and trypsin / proteinase K digestion methods. One of these fungi was ABP producer. Molecular characterization of ABP producer filamentous fungus was made and it was determined that this species is Aspergillus tubingensis. The proteins isolated by trichloroacetic acid (TCA) method and are shown by SDS-PAGE and tricine-PAGE. This ABP molecule was determined by MALDI-TOF/MS. The minimum inhibitory concentration (MIC) value for S. aureus was 32 mg / L, and the minimum biofilm inhibitory concentration (MIC) value was 2 mg / L. This protein is uncharacterized protein (A0A1L9MXD7_ASPTU) from UniProt database. In conclusion, the presence of ABP in filamentous fungi has been demonstrated for the first time and the potential ABP that can be used in biofilm related infections of S. aureus has been suggested.