Boyarmaddeler ile boyanmış proteinlerin proteolitik enzimler için substrat olarak kullanılabilirlikleri

Abstract

11 ÖZET Proteolitik enzimlerin yaygın olarak kullanılan substratlan protein ve protein fragmentleri (kazein, pepton v.s.) olmasına karşın, aktivitelerinin tayininde yün, pamuk gibi çözünmeyen uygun materyal üzerine adsorblanan boyalarla hazırlanan substratlar da kullamlmaktadır. Bu düşünceden yola çıkarak sıkça kullanılan proteolitik enzimlerden subtilizin Carlsberg, tripsin, kimotripsin ve proteaz tip XVI için, kolay ve ekonomik olarak elde edilebilecek, çevre kirliliğine neden olmayacak ve de olası ise bu enzimlerden en azından biri için özgün substrat geliştirilebilirliğini araştırmak amacıyla yün ve kazein; juglon, lawson, berberin ve quercetin gibi doğal ve procion red, procion blue ve procion yellow gibi sentetik boyalarla boyandı. Kullanılan doğal ya da sentetik boyarmaddelerin çok düşük derişimlerinde (doğal boyarmadde 1.1 0`12 M ve sentetik boyarmadde 1.0x1 0`9 g.mL`1) bile enzimlerimizi tersinmez bir şekilde inhibe ettiği saptandı. Hazırlanan yün-boyarmadde kompleksleri üzerinde enzimlerin etkisini sodyumbisülfit yokluğunda incelediğimizde, subtilizin carlsberg, tripsin ve kimotripsinin katalitik etkinlik göstermezken, %5 sodyumbisülfit içeren proteaz tip XVP nın katalitik etkinlik gösterdiği görüldü. Diğer enzimlere de aynı oranda sodyumbisülfit ilave edildiğinde katalitik etkinlik gösterdiği görüldü. Sodyumbisülfit varlığı, kullanılan enzimlerin katalitik etkinliğini farklı oranlarda değiştirdi. Çözünmez substrat olarak hazırlanan yün-boyarmadde kompleksleri üzerine tüm enzimlerin etkisi, doğal boyarmaddelerle hazırlanan substratlardan yün-lawson kompleksi en uygun, yün-quercetin kompleksleri de en uygun olmayan, sentetik boyarmaddelerle hazırlanan substratlardan yün-p. yellow en uygun, yün-p. blue ise en uygun olmayan substrat olduğu saptandı. Çözünür substratlar olarak hazırlanan kazein-boyarmadde kompleksleri üzerine subtilizin carlsberg, proteaz tip XVI, tripsin ve kimotripsinin katalitik etkinlikleri incelendi. Her bir enzim için belirlenen optimal koşullarında hazırlanan kazein-boyarmadde komplekslerinin artan derişimlerine bağlı olarak katalitik etkinlikleri incelendi. Bu verilerden yün-boyarmadde kompleksleri substrat olarak kullanıldığında elde edilen sonuçlara benzer sonuçlar kazein-boyarmadde kompleksleri için de eldeIll edildi. Substrat uygunluk sırası doğal boyarmaddelerle lawson, juglon, berberin, quercetin; sentetik boyarmaddelerle p. yellow, p. red, p. blue şeklinde olduğu Km ve kcat/Km değerlerinden görülebilir. Kazein-boyarmadde kompleksleriyle, yün- boyarmadde komplekslerinde olduğu gibi en düşük etkinlik subtilisin carlsberg için gözlendi. Sonuç olarak hazırlanan bütün komplekslerin kullanılan enzimler için substrat olarak kullanılabileceği görüldü.

IV ABSTRACT In spite of protein and protein fragments (casein, pepton and etc.) are used widespread as a substrate for the proteolytic enzymes, the substrate prepared from dyes that adsorbed on appropriate material, such as wool and cotton are also used for enzymes activity determination. In the point of view of this thought, it was our aim to develop the substrates which are easily and economically obtainable and also environmental safer, for the frequently used proteolytic enzymes such as subtilisin carlsberg, trypsin, chymotrypsin and protease type XVII and if it is possible to prepare the specific substrate at least for one of this enzymes. For this aim, wool and casein were dyed with natural dyes such as juglone, lawsone, berberine and quercetine and synthetic dyes, P. Red, P. Blue and P. Yellow. Our finding imply that the enzymes used in this study were reversibly inhibited even at lowest concentration ( 1.10`2 M natural dyes and 1.10`9 g-mL`1 synthetic dye) of used natural and synthetic dyes. The effect of enzymes on prepared wool-dyes complex in the absence of sodiumbisulphite w ere i nvestigated. T he c atalytic a ctivity w as n ot o bserved for subtilisin carlsberg, trypsin and chymotrypsin. On the other hand, the catalytic activity was observed for the protease type XVII that is contain 5% of sodiumbisulphite. These findings lead us to believe that the catalytic activities of used e nzymes h ave b een c hanged i n t he p resence o f s odiumbisulpbite a t d ifferent ratio. The results indicate that the effect of all the tested enzymes on wool-dye complex as a insoluble subtrate, the most appropriate complex were found to be wool-lawsone complex that was prepared from the natural dyes and the most ^inappropriate complex was to be w ool-quercetin complex. On the other hand, the substrate prepared form synthetic dyes, the most appropriate complex was found to be wool-p. yellow and the most unappropriate complex was found to be wool-p.blue complex.The catalytic activities of subtilisin casrlsberg, protease type XVII, trypsin and chymotrypsin on casein-dye complexes that was prepared as a soluble substrate, were investigated. The catalytic activity of each enzymes was studied with the increase concentration of prepared casein-dyes complexes. These finding provide evidence that the results obtained with wool-dyes complexes as a substrate were similar to the results obtained from the casein-dye complexes. The appropriate order of substrate for natural and synthetic dyes can be seen by looking the values of Km and kcat/Km. These order were found to be L awsone, Juglone, Berberine and Quercetin for natural dyes and P. Yellow, P. Red and P. Blue for synthetic dyes. The lowest activity was observed for subtilisin carlsberg for the casein-dye complexes as seen in the wool-dye complexes. From our results, we suggest that all the prepared complexes can be used as a substrates for used enzymes.