Alicyclobacillus acidocaldarius subspecies rittmannii`nin ß-galaktozidaz enzimi üzerine çalışmalar

Abstract

11 ÖZET Bu çalışmada kullanılan Alicyclobacillus cinsine ait MR1 varyetesi Antartika'da ayak basılmamış bir bölgedeki toprak numunelerinden izole edilmiştir. MR1 izolatı Alicyclobacillus 'lara özgü terminal bir siklohekzan bulunduran yağ asitleri içeren lipitler ihtiva etmektedir. Ayrıca, 16S ribozomal DNA analizi ve DNA-DNA homolojisi karşılaştırılmasında bu varyetenin Alicyclobacillus acidoca.ldarius'xax yeni bir alt türü olduğu bulunmuştur (Nicolaus ve ark., 1998). Genetik analizi yapılarak tanımlanan ve patojen olmayan bu bakteri çalışmalarımızda test edilmiştir. Laktozlu ve laktozsuz ortamlarda yaptığımız testlerde, laktozun 24. saate kadar bakteri çoğalması üzerine herhangi önemli bir etkisi olmadığı, ancak 24. saatten sonra bakteri çoğalmasını artırdığı görüldü. Canlı hücrelerde pH'nın p-galaktozidaz aktivitesi üzerine etkisi sodyum sitrat tamponu (PH 4-6) ve sodyum fosfat tamponu (pH 6-9) kullanılarak araştırıldı. Laktozsuz ortamda optimum pH 6, laktozlu ortamda ise optimum pH 7 olarak bulundu. PH 4 ve pH 9 'da her iki ortamda da relatif aktivite (optimum pH'ya kıyasla) 0 (sıfır) olarak tespit edildi. 40-80 °C aralıktaki sıcaklığın enzim üzerine etkisi incelendiğinde; laktozsuz ortamda optimum sıcaklık 60 °C, laktozlu ortamda ise optimum sıcaklık 70 °C olarak bulundu. Laktozlu ortamda 40 ve 50 °C 'lerde relatif aktivitenin laktozsuz ortama göre oldukça yüksek olduğu tespit edildi. Laktozun enzimin stabilitesinde rol aldığı tahmin edilmektedir. 80 °C 'de her iki ortamda da enzim aktivitesi 0 (sıfır) olarak tespit edildi. Sentetik indükleyici IPTG'nin laktoz gibi enzim sentezini indüklediği bulundu. Bakteri hücreleri lizozim enzimi yardımıyla lize edilerek elde edilen enzim solüsyonlarında p-galaktozidaz aktivitesi üzerine pH'nın etkisi 0.1 M sodyum fosfat tamponu (pH 6-9) kullanılarak araştırıldı. Enzimin optimum pH'sı 6 olarak saptandı. 40-80 °C aralıktaki sıcaklığın enzim üzerine etkisi araştırıldı ve enzimin optimum sıcaklığı 60 °C olarak tespit edildi. Enzim ünitesi Lambert-Beer yasasından yararlanarak ünite/ml olarak hesaplandı. 6-48 saatler arasında kültüre alman bakterilerde laktozlu (%1) ve laktozsuz ortamlarda zamana bağlı enzim üretimi çalışıldı. İnkübasyon periyotlarından sonra bakteriler lizozimle lize edilmiş ve elde edilen enzim solüsyonlarında hem enzim aktivite tayini hem de protein miktar tayini yapılarak spesifik aktivite (u/mg) bulunmuştur. Laktozlu ortamda çoğalan hücrelerdeki p-galaktozidaz aktivitesinin 6-24. saatlerde laktozsuz çoğalanlara nazaran oldukça fazla olduğu görüldü. Bununla beraber, 24. saattenIll sonra enzim aktivitesinde bir düşüş görüldü. Laktozsuz ortamda ise 12. saatten 24. saate kadar hızlı bir artış görülmesine rağmen, sonrasında artış hızının yavaş seyrettiği görüldü. Yukarıda tespit edilen sonuçlar non-denatüre jel elektroforezi ile teyit edildi. Sigma'dan elde edilen prestained moleküler weight marker'lar kullanılarak P-Galaktozidaz'ın görünen moleküler ağırlığı 155 ± 5 kD olarak hesaplandı.

IV SUMMARY MR1 strain used in the present study, belong to Alicyclobacillus, was isolated from the unexplored geothermal soil in Antartica. MR1 isolate contains lipid consisting of terminal cyeloheksane fatty acids specific to Alicyclobacillus. Moreover, the comparison of 16S rDNA analysis and DNA-DNA homology showed that this strain is a novel subspecies of Alicyclobacillus acidocaldarius (Nicolaus et al. 1998). This non-patogenic bacteria has been tested throughout the study for p-galactosidase activity. Tests carried out in media with and without lactose showed that lactose is not effective on bacterial growth up to 24 hours, but cause some increase after 24 hours. The pH effect on p-galactosidase activity in whole cells was examined using Na citrate buffer (pH 4-6) and Na phosphate buffer (pH 6-9). The optimum pH of enzyme in bacteria grown on media without lactose was 6, while in media with lactose optimal pH was found as 7. The relative activity at pH 4 and pH 9 in both media was zero (0). The temperature effects on enzyme activity were tested at the range of 40-80 °C; the optimum temperature of enzyme in bacteria at media without lactose was 60 °C, whereas it was 70 °C for the bacteria grown on lactose. Relative activities at 40 and 50 °C are found higher in bacteria grown on lactose compared to those grown in media without lactose. It is thought that lactose play a role in enzyme stability. The relative activity at 80 °C was found as zero in both media. The synthetic inducer IPTG induced the enzyme biosynthesis as lactose does. The pH effect on P-galactosidase activity in enzyme solutions obtained after lysing the cells with lysozyme enzyme was tested in 0. 1 M Na phosphate buffer (pH 6-9). The optimum pH was found as 6. The temperature effects on enzyme activity was also tested at the range of 40-80 °C; the optimum temperature of enzyme was 60°C. The enzyme units were calculated as unit/ml, using the Lambert-Beer law. The time course experiments for enzyme production between 6-48 hours were carried out in bacteria grown in media with and without lactose (1%). After incubation periods, the bacteria are lysed and both enzyme activity and protein concentrations were determined in enzyme solutions for spesific activity (u/mg) calculations. The p-galactosidase activity in bacteria grown on lactose was significantly higher between 6-24 hours compared to that grown without lactose. However, there was a decrease in enzyme activity after 24 hours. Although there was a great increase in bacteriaconstitutively in non-lactose media between 12-24 hours, the enzyme activity was steady after 24 hours. The results obtained as described above was confirmed by using non-denaturing gel electrophoresis. The apparent molecular weight of p-galactosidase was calculated as 155 ± 5 kD, using prestained molecular weight markers from Sigma.