Pleurotus ostreatus ve Ceriporiopsis subvermispora CZ-3 lakkazlarının; indükleyiciye bağlı verimli salgılanma koşullarının ve indigo boyalar üzerindeki etkilerinin iyileştirilmesinde uygun medyatörün araştırılması

Abstract

Lakkazlar (EC 1.10.3.-, p-difenol:dioksijen oksidoredüktaz) bakır iyonları içeren oksidaz grubu enzimlerdir. Bu grubun bir üyesi ilk kez Japonya'da lake ağacının (Rhus vernicifera) reçine kanallarının bir bileşeni olarak 19. yüzyılın sonlarında keşfedildi. Doğada yaygın olarak bulunan ve glikoprotein olan, molekül ağırlıkları 50.000 ila 130.000 arasında değişen lakkazların ana kaynağını funguslar oluşturur. Son ürün olarak yalnızca su oluşturdukları için çevre dostu olarak tanımlanan bu enzim grubuna ilgi son zamanlarda giderek artmıştır.Şimdiye kadar yüzün üzerinde lakkaz izole edilerek değişik kapsamlarda karakterize edilmiştir. 1990'da ABTS'nin lakkaz substrat medyatörü olarak davrandığı ya da bu bileşiğin enzimin etkisini artırdığı fark edildikten sonra çok sayıda başka bileşiğin de bu amaca yönelik kullanılabilirlikleri araştırılmıştır. Sonuç olarak lakkaz enziminin izole edildiği kaynağa ve/veya üzerine etkiyeceği substrata bağlı olarak medyatör niteliğine sahip bileşiğin değişebildiği saptanmıştır.Amaca uygun lakkaz/medyatör sistemlerinin geliştirilmesi, ilgili endüstrilerde dışarıya bağımlılığı azaltacağından, ürünün maliyetinin düşmesine katkı sağlar. Bu çalışmada organizmanın cinsine, türüne ve ona ürettirilmek istenen maddeye bağlı olarak değişim gösterebileceği düşüncesinden yola çıkarak, Pleurotus ostreatus ve Ceriporiopsis subvermispora'nın katı faz kültivasyon teknikleri kullanılarak test edilen indükleyicilerin etkisi ile en iyi miktarda ve en yüksek oranda aktiviteye sahip lakkaz enzimi/enzimleri salgılamalarının koşulları araştırıldı. C. subvermispora ve P. ostreatus kavun kabuğu, karpuz kabuğu ve kızıl çam kozalığının destek metaryel olarak kullanıldığı yarı katı faz fermantasyon tekniği ile üretilip indükleyiciye bağlı lakkaz salgılama koşulları protein miktar tayini ve lakkaz aktivitesi testi yapılarak araştırıldı.Destek materyale ilave edilen ve 4 farklı indükleyicinin (2,5-ksilidin, 3,5-ksilidin, 2,4-ksilidin ve sentezlenen (4E)-4-(2,5-Dimetilfenilimino)-2,5-dimetil siklohegza-2,5-dienon) iki ayrı derişimlerini içeren 25 mL sıvı besi yeri ortamında yüksek miktarlarda lakkaz üretimine, yapılan enzim aktivitesi sonucunda 16. günde ulaşıldığı belirlendi. C. subvermispora'nın, indükleyici olarak kullanılan 2,4-ksilidinin 5000 µM derişimi ile sentezlene maddenin 5 µM derişiminde kavun kabuğunun bulunduğu besi ortamındaki inkübasyonun 16. gününde en yüksek miktarda lakkaz ürettiği tespit edildi. P. ostreatus'un ise 16. günde sentezlenen bileşiğin 5 µM ve 2,5-ksilidinin 5000 µM derişiminde kavun kabuğu ile inkübe edildiği koşullar altında en iyi miktarda lakkaz ürettiği belirlendi.Ayrıca enzimlerin tekstil endüstrisinde yaygın olarak kullanılan indigo boyaları renksizleştirmesi için katalitik etkinlik gösterebileceği redoks medyatörünün belirlenmesine yönelik çalışmalar yapıldı. İndigo boya üzerine seçilen medyatörlerin Siringate ve 1-hidroksibenzotriazol (HBT) ile kıyaslandığında renksizleştirmede genellikle etkili olmadıkları ancak indigo Carmin'in renksizleştirilmesinde 1-(4-Sulfophenyl)-3-methyl-5-pyrazolone, 3-Methyl-1-(4?-sulfoamidophenyl)-5-pyrazolone medyatörlerinin en az Siringate yada HBT kadar etkili oldukları gözlendi.Anahtar Kelimeler: Fungus, faz kültivasyonu, indükleyici, lakkaz, medyatör, indigo renksizleştirme

Laccases (EC 1.10.3.2, p-diphenol:dioksijen oxidoreductase) are oxidases that consist of copper ion. In the late nineteenth century, a member of that group was first discovered as a compound of resin ducts of lacquer tree in Japan. Fungi form the main source of the laccases which are found in nature widely and the weigth of glycoprotein molecules of them change from 50.000 to 130.000. Interest in that enzyme group, which are known as environment friendly since they form as a last product, has increased recently.Over one hundred of laccases have been isolated and categorized in different contexts, so far. After it was realized that ABTS acted as laccase substrate mediator and enzyme of that compound increased it?s effect in 1990, lots of enzymes were researched in terms of their utility fort his purpose. As a result it was determined that compound with a mediator nature can change depending on the source from which laccase enzyme is isolated and/or on the substrate it will affect.As improvement of suitable laccase/ mediator system will decrease dependence on imports in relevant industries it will also contribute to reducing the costs. In this study, based on the assumption that organism can differ depending on it?s type and matter it made produced, conditions to secrete laccase enzymes were researched. They had activity at the best and highest amount because of the inductive affect that were tested by using solid-phase cultivation techniques. Pleurotus ostreatus and Ceripori opsis subvermispora was produced by semi-solid fermentation technique in which melon peel, watermelon peel and red pine cone was usedas suporting material. Afterwards it was researched by using laccase activity testing, laccase secretion conditions and protein quantification. 25 ml liquid consisting two different con centration of four different inductive (2,5-xsilidine, 3,5-xsilidine, 2,4-xsilidine and synthesized (4E)-4-(2,5-Dimethlyphenylimino)-2,5-Dimethlsiklohegza-2,5-dienon)which was added to supporting material was determined to achieve to high amount of laccase production in medium environment in sixteenth day as a result of enzyme activity. It was determined that in 2,4-xsilidine 5000 µM concentration of C. subvermispora which is used as inductive and in 5 µM synthesized material, incubation in medium environment produce highest amount of laccase at sixteenth day. 5 µM and 2,5-xsilidine compound of P. ostreatus which is synthesized in sixteenth days was determined to produce best amount of laccase when it was incubated with watermelon peel in 5000 µM concentration.Some studies were made to determine redox mediator. They can show catalytic activity of enzyme for decolorisation of indigo dyes which is used in textile widely. It was observed that mediators which were chosen on indigo dye were not generally affective on decolorisation when compared with methylsringeyt and 1-hydroxybenzotriazole (HBT). But it was also observed that in the decolorisation of the indigo Carmine 1-(4-Sulfophenyl)-3-methyl-5-pyrazolone, 3-methyl-1-(4 ? -sulfoamidophenyl)-5-pyrazolone mediators were as effective as methylsringeytor HBT.Key words: Fungus, cultivation phase, inductive, laccase, mediator, indigo decolo risation