Bacillus cereus KG5` in proteaz enzimi üzerine çalışmalar

Abstract

Bu çalışmada, Kös (Bingöl) kaplıcasından izole edilen Bacillus cereus KG5' in endüstride geniş uygulama alanına sahip olan ekstraselüler proteaz enzimi üzerine çalışmalar yapılması amaçlanmıştır.B.cereus KG5 BM besi yerinde kültüre alındı ve değişik inkübasyon sürelerinde proteaz aktivite tayini yapılarak maksimum enzim üretimi 24.saatte tespit edildi. pH ve sıcaklığın proteaz enzimi üzerindeki etkisi pH 6-11 ve sıcaklık 20°C ile 70ºC aralığında araştırıldı. Enzimin optimum pH ve sıcaklık değerinin sırasıyla 7.0 ve 40-45ºC arası olduğu tespit edildi. Farklı besi yerlerinin, %1.2 oranında farklı azot ve %2 oranında karbon kaynaklarının enzim üretimi üzerindeki etkisi incelendi. Maksimum enzim üretimi BM besi yerinde elde edildi. En iyi azot kaynağı yeast ekstrakt ve üre, en iyi karbon kaynağı ise laktoz ve galaktoz olarak belirlenirken karbon kaynaklarından glukozun enzim üretimini inhibe ettiği tespit edildi. Farklı yeast konsantrasyonlarının enzim üretimi üzerindeki etkisi araştırıldı. %0.5 yeast ekstraktta maksimum enzim üretimi elde edilmiştir. Artan yeast ekstrakt konsantrasyonlarında enzim üretiminde azalma gözlenmiştir. %0.5 oranında farklı metal iyonlarının enzim üretimi üzerindeki etkisi araştırıldı. CaCl2' nin enzim üretimini yaklaşık 2 kat arttırırken, NaCl ve MgCl2' nin üretimi önemli ölçüde azalttığı tespit edildi. CaCl2' nin enzim üretimi üzerindeki etkisi araştırıldı. Maksimum enzim üretimi %0.5, en düşük üretimin ise %0 CaCl2 konsantrasyonlarında elde edilmiştir.B.cereus KG5' e ait kısmi olarak saflaştırılan proteaz enzim aktivitesi üzerine bazı metallerin, kimyasalların, metal şelatörlerin ve deterjanların etkisi araştırıldı. CaCl2 (2 mM' da %142), MgCl2 (5 mM ve 10 mM' da %89) ve MnCl2'nin (2 mM' da %29) proteaz aktivitesini belirli oranlarda arttırdığı, CuCl2, HgCl2 ve ZnCl2 (10 mM' da) ise enzim aktivitesini sırasıyla %100, %100' den fazla ve %96 oranında inhibe ettiği ve metal şelatörleri olan EDTA ve 1-10 phenantroline'nin (10 mM' da sırasıyla %96 ve %95) proteaz enzimini güçlü bir şekilde inhibe ettiği tespit edildi. PMSF'nin etkisinde ise etanole bağlı bir inhibisyonun olduğu belirlendi. % 1 SDS'nin tamamen, %1 Alo' nun %84 oranında, %0.5 Triton X-100' ün %5 oranında ve %0.1 Tween-80' in % 2 oranında enzim aktivitesini inhibe ettiği tespit edilmiştir. Enzimin termal stabilitesinin araştırılması sonucunda 40ºC' de 120 dakika sonunda enzimin oldukça stabil olduğu tespit edilmiştir. Enzimin termal stabilitesinin CaCl2 tarafından arttıldığı belirlendi. 2 mM CaCl2 enzimin 50ºC' de 120 dakika sonunda orijinal aktivitesini % 102 oranında koruduğu tespit edildi.Bu çalışmada B.cereus KG5' e ait proteaz enzimi amonyum sülfat çöktürmesi&diyaliz ve Sefadeks G-75 jel geçirgenlik kromatografisi ile %23 verimle 13 kat saflaştırıldı. Sefadeks G-75 jel geçirgenlik kromatografisi ile saflaştırılan enzimin nondenatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile varlığı tespit edilirken, SDS-PAGE ile de molekül ağırlığı yaklaşık 48 kDa civarında olduğu tespit edildi.Anahtar Kelimeler: Bacillus cereus KG5, Biyoteknoloji, proteaz enzim üretimi ve karakterizasyonu

In this survey it is aimed to study the extracellular protease enzyme which has a wide application in the industry of Bacillus cereus KG5 which has been isolated in Kös (Bingöl) hot spring.B.cereus KG5 BM has taken under culturization at thee feed-lot and protease activity is determined at various incubation times and the maximum enzyme production is determined at the 24th hour.The effect of pH and temperature over the protease enzyme is studied under pH 6-11 and t between 20°C and 70ºC temperatures. It was determined that the optimum value of pH and temperature for the enzyme is respectively 7.0 and 40-45ºC. The effects of different feed-lots and %1.2 percent different nitrogen and %2 percent carbon sources has been studied. The maximum enzyme production is acquired at BM feed-lot. It is determined that the best nitrogen source is yeast ekstrakt and urea, the best carbon source is lactoz and galaktoz meanwhile glukoz as a source of carbon inhibated the production of the enzyme. Different consantrations of yeast effect over enzyme production is studied. The maximum enzyme production is acquired at %0.5 yeast extract. It is observed that the enzyme production is degraded by yeast extract increase. Different metal ions effect at the ratio of %0.5 percent over enzyme production is studied. The CaCl2 approximately doubled the enzyme production, NaCl ve MgCl2 dramatically reduced the enzyme production. CaCl2?s effect over enzyme production is studied. The maximum enzyme production is acquired at %0.5, and the lowest enzyme production is acquired at %0 CaCl2 consantrations.Some metals, chemicals, metal chelat agents and detergents effects over protease enzyme activity that is belonging to partially purified B.cereus KG5 is studied. CaCl2 (%142 at 2 mM ) , MgCl2 (%89 at 5 mM and 10 mM) and MnCl2 (%29 at 2 mM) increased the protease activity at a certain extent, CuCl2, HgCl2 and ZnCl2 (at 10 mM) inhibated the enzyme activity respectively at %100, over %100 and %96, EDTA and 1-10 phenantroline which are metal chelat agents (respectively %96 and %95 at 10 mM) heavly inhibated the protease enzyme. At the effect of PMSF, an inhibition due to etanolet has been determined. It is determined that the enzyme activity is inhibated at % 1 SDS fully, %1 Alo at %84 percent, % 0.5 Triton X-100 at % 5 percent and 0.1 Tween-80 at % 2 percent . As a result of studying the thermal stability of the enzyme, it is determined that it is stil stable at 40ºC temperature at the end of 120 minutes. İt is determined that the thermal stability of the enzyme is increased by CaCl2 . It is determined that 2 mM CaCl2 enzyme at 50ºC temprerature at the end of the 120 minutes still preserved the original stability at % 102 percent.In this study, the protease of B.cereus KG5 was purified by amonium sulfate precipitation&dialysis and Sephadex G-75 gel permeability chromatography with 13 fold and %23 recovery.The enzyme purified by the Sephadex G-75 gel permeability chromatography existence is determined by nondenaturing polyacrilamide gel electrophoresis meanwhile the molecule weight is determined approximately 48 kDa by SDS-PAGE.Key words: Bacillus cereus KG5, Biotechnology, protease enzyme production and characterization.