Sakız ağacı (Pistacia lentiscus L.) `nın in vitro klonal mikroçoğaltılması

Abstract

Sakız ağacının (P. lentiscus L.) klonlanmış dört genç genotipinin sürgün uçları kullanılarak bir mikroçoğaltma protokolü geliştirildi. Olgun tohumlardan aksenik explantların üretimi için etkili bir yüzey sterilizasyonu metodu geliştirildi. Olgun tohumların yüzey sterilizasyonu üzerine çalkalama süresi ve sodyum hipokloritin farklı konsantrasyonlarının etkisi ve aksenik sürgün uçlarından klonal sürgün çoğaltılması, köklenmesi ve köklenmiş fideciklerin in vivo koşullara alıştırılması gibi faktörler araştırıldı. Aşağıdaki yüzey sterilizasyonu, sürgün çoğaltılması, köklenme ve alıştırma parametreleri rapor edildi: enfekte olan ve enfekte olmayan tohum oranı, ortalama sürgün sayısı, ortalama sürgün uzunluğu, köklenme yüzdesi, adventif kök sayısı, kök uzunluğu ve 5 ve 8 hafta alıştırmadan sonra yaşayan renerant oranları. Anaç kontrol grubu ile birlikte 6., 9. ve 12. altkültürdeki bitkilerden alınan yapraklardan DNA?lar izole edildi ve Retrotranpozon Arası Çoğaltılmış Bölge Polimorfizmi (IRAP) primeri kullanılarak bir PCR aracılığıyla analiz edildi. Sakız tohumlarının çimlenmesi için %20?lik NaOCl ile 20 dakikalık çalkalama optimum kombinasyon olarak bulunmuş olup bu kombinasyonda tohumlar aşırı steril olmadan ve bozulmadan çimlenme oranı %88.30 gerçekleşti. Sakız ağacı sürgünlerinin çoğaltılması safhasında dört farklı besi ortamının etkilerine göre, MS besi ortamı eksplant başına en yüksek oranda (3.44) sürgün ile birlikte maksimum sürgün proliferasyonu (%100) ile en iyi sonuçları verdi. Kültüre alındıktan 28 gün sonra, en çok sürgün sayısı (3.60?0.13) ve sağlıklı sürgün uzunluğu (16.80?0.20) 1 mgl-1 BA içeren ½ ve ¼ kuvvetindeki MS besi ortamında kültürlenen Klon-II?de elde edilirken, en düşük oranda sürgün sayısı ise, Klon-I?de QL?li ve Klon-II?de WPM besi ortamında elde edildi. Çalışılan sitokininler arasında sürgün sayısı ve uzunluğu bakımından sürgünlerin morfojenezi BA destekli ortamda optimum olarak belirlenirken, 1 mgl-1 BA ve 2iP?li besi ortamında en uzun sürgünler elde edilmiştir. Klone-II?de sitokinin tipine bağlı olmaksızın rizogenes gözlendi. Klon-II regenerantları ile test edilen farklı BA konsantrasyonları arasında 2 mgl-1 BA?lı ortamda en fazla sürgün (2.92±0.36) gelişti. Özellikle Klon-II regenerantları %3?lük fruktozlu ortamda sakkaroz, laktoz ve glikozdan daha fazla ve daha uzun sürgün oluşturdu. Klon-II?de eksplant başına maksimum sürgün sayısı (3.62) 1 mgl-1 BA ve 30 g/l fruktoz içeren MS besi ortamında rapor edildi. Fakat sürgünlerin genel büyüme ve görünüşleri sakkarozlu besi ortamında fruktoz, glikoz ve laktozlu ortama göre daha iyi olduğu gözlendi. IBA?nın çalışılan en yüksek konsantrasyonunda güçlü köklenme teşvik edildi ve bu orandaki IBA?lı ortamda Klon-II?ye ait mikrosürgünler %94 oranında köklendi. Klon-II?de test edilen bütün kontrol grubu çalışmalarında olduğu gibi %25?i köklendi. Bu bağlamda Klon-II?nin diğer klon hatlarına göre daha iyi olduğu görüldü. Köklenen sürgünlerin aklimitizasyonu için tanımlanan bu protokol başarılıdır. Çünkü büyüme odasında yaşayan bitki oranı aklimitizasyondan iki ay sonra %95 olarak rapor edildi. Elde edilen verilere göre oluşturulan dendrogram incelendiğinde çekici varyasyonun Klon-II?de olduğu gözlendi. I., II. ve IV. klonlara ait ana bitki ve 6., 9. ve 12. altkültürlerde ise varyasyonun Klon-II?ye kıyasla daha düşük düzeyde olup, klonların genetik olarak nispeten biraraya toplandıkları belirlendi. Ana bitkiye genetik olarak en yakın klonların Klon I ve III?ün 6. alt kültürüne (I-6, III-6) ait olduğu tespit edildi. Ayrıca, Klon-I?de ana bitki ile en uzak altkültürün 12. altkültür (I-12) olduğu belirlendi Tez kapsamında sakız ağacında ilk defa IRAP belirteci kullanılarak yapılan moleküler analizde %80 oranında benzerlik bulunmuştur. Ortalama 0.331 olan PIC değeri klon spesifik ve altkültür sayısı ilgili olsa da, klonlar arasında düşük seviyede de olsa polimorfizm gerçekleştiğini göstermektedir. Ayrıca, bu çalışma IRAP?ın sakız ağacının farklı klonları arasında ve içinde bu tip polimorfizmin belirlenmesinde başarılı bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir. Geliştirilen protokol olgun ve seçkin sakız ağaçlarının in vitro klonlanması için iyi bir model olduğu düşünülmektedir. Ancak, klonlama için organogezisin geliştirilmesi in vitro şartlarda seçkin ağaçlarda rejuvenasyon veya rejenerasyon protokollerinin geliştirilmesi gereklidir. Organogezis üzerine yapılacak olan daha ileri çalışmalar tamamlanmadan bu potansiyeli açığa çıkarmak mümkün olmayacaktır. Anahtar kelimler: P.lentiscus L., Sakız ağacı, Mikroçoğaltım, Klon, IRAP

A method was developed for micropropagation of lentisk, Pistacia lentiscus L., and using shoot tips from seedlings of four cloned genotypes. An effective surface sterilization method for the production of sterile explants from mature seeds of lentisk was achieved. The factors controlling the effect of immersion time, the effect of NaOCl concentrations on surface sterilization, the clonal shoot proliferation, rooting and acclimatization of plantlets derived from mature fruit explants were investigated. The following surface sterilization, multiplication, rooting and acclimatization parameters were monitored: Contaminated and decontaminated seeds, mean shoot number, mean shoot length, % of rooting, adventive root number, root length, % of viable regenerants after five and 8 weeks. DNAs from leaves of regenerated plants along with parental controls were isolated and analyzed through PCR using 5 Interretrotransposon Amplified Polymorphism (IRAP) Primers. A 20% NaOCl x 20 min treatment was the optimum combination in NaOCl to sterilize lentisk seeds because there were 88.30% germination success and no oversterilized or malformed seeds. Analysis of the effect of all 4 medium types on multiplication phase of lentisk infers that MS gives the best results with the maximum shoot proliferation (100%) together with the highest number of shoots (3.44) per explant. After 28 days of explanting, the best response in terms of number (3.60?0.13) and length of (16.80?0.20) healthy shoots in Clone-II was obtained with 1/2x MS and 1/4x MS together with 1 mgl-1 BA, and the poorest responses with the QL medium in Clone-I, and the WPM with Clone-II. BA was found to be optimum for shoot morphogenesis in terms of the number and length of shoots among the cytokinins tested, while the highest shoot length was also yielded by BAP and 2iP each at 1.0 mg/l. Regardless of cytokinins applied, Clone-II induced rhizogenesis to some extent. BA produced the greatest number of plantlets (2.92±0.36) with optimal multiplication at approximately at 2 mgl-1 among the different concentrations tested with Clone-II. Shoot tips grown on 3% fructose medium produced more and longer shoots than those on sucrose, lactose or glucose again for Clone-II. The maximum number of shoots per explant (3.62) for Clone-II was recorded on MS medium containing 1 mgl-1 BA and 30 g/l fructose but the general appearance and growth habit of shoots were better on medium with sucrose than fructose, lactose and glucose. IBA induced strong rooting at the highest concentration (4 mgl-1) and it produced the greatest percentages of rooting (94%) with Clone-II, and 25% of explants cultured also rooted in the control treatment. In this context, the result of Clone-II was superior to those of the rest of the clones tested. The method developed for plant acclimatization was satisfactory because a high percentage of plant survival (95%) in the growth room was obtained and the regenerated plantlets resumed growth after 2 months. It was observed that Clone-II has interesting variation when the dendograms were constructed. Index of genetic variation for Clones I, II and III was lower in the mother plants and the regenerants of 6, 9 and 12 times subcultured cultures. The six times subcultured regenerants of the clones I and 6 (I-6, III-6) was the most closest to the mother plants whereas the regenerants of the clone I was the furthest from the mother plant when they were subcultured 12 times. The correlation coefficient between similarity matrices based on IRAP was 80% and this was found by using the IRAP which is dominant, multiplex marker system that examine variation in retrotransposon insertion sites. Our study, the mean value of PIC, 0.331 indicates that tissue culture generates a low level of variation, which is related with incubation time and is clone specific. Moreover, IRAP can successfully be used to explore such polymorphism within and among different clones of lentisk. Reported results undoubtedly suggest that the cytokinins, auxins, media and carbohydrate type and concentration suitable for micropropagation of lentiks are genotype-dependent. The protocol developed holds also good model system for in vitro cloning of mature elite lentisk trees. However, the exploitation of organogenesis for cloning requires developing protocols to regenerate and/or rejuvenate mature elite-trees under in vitro conditions. It will not be possible to realize the potential without further extensive research on organogenesis.Keywords: P.lentiscus L., Mastic Tree, Clone, Micropropagation, IRAP