Cloning and characterization of α-amylase from Bacillus circulans ATCC 61

Abstract

En önemli enzim grubunu oluşturan amilazlar, biyoteknolojide de büyük önem kazanmaktadır. Mikroorganizmalardan elde edilen enzimler endüstriyel alanlarda yaygın bir şekilde kullanılır. Mevcut çalışmada Bacillus circulans ATCC 61 ?-amilaz üretimi için kullanılmıştır. Bakterinin ?-amilaz üretmesi ve genom yapısı iyi bilindiğinden klonlama işlemi için kullanıldı. Bacillus circulans ATCC 61'in genomik DNA'sı izole edildi ve α-amilaz enzimini kodlayan amyE geni 1400 bç uzunluğundaki spesifik primerler kullanılarak PCR yöntemi ile çoğlatıldı. Bacillus α-amilaz'ına ait genler gen kütüphanesinde tarandıktan sonra uygun primer tasarlandı. PCR protokolünden sonra jelden saflaştırılan gen ürünleri 3015 bç uzunluğunda ve her iki 3' ucunda terminal timidin bulunan lineer pGEM®-T Easy vektörüne aktarıldı. İnsertisyon bölgesinde bulunan tek zincirli T kuyruklar, A-kuyruğuna sahip PCR ürünlerinin etkin bir şekilde ligasyonunu sağlar. Taq DNA polimeraz, PCR ürünlerinin sonuna bağımsız bir şekilde tek zincirli deoksiadenozinler sentezler. Klonlanan gene ait bioinformatik analizler, bu genin Bacillus sp. ?-amilaz geni ile %100 oranında bir benzerliğe sahip olduğunu göstermiştir. Son olarak gen eksperesyonu için vektör, yüksek etkiye sahip JM109 E. coli competent hücrelerine transfer edildi. Bu çalışma Bacillus circulans ATCC 61'den α- amilaz enziminin klonlanması bakımından literatürdeki ilk kayıttır.

Amylases are one of the most important enzymes and have a great significance in the present industry of biotechnology. Enzymes obtained from microorganisms are widely used in the industrial field. In the present work, Bacillus circulans ATCC 61 for ?-amylase production has been used. Because well known as a producer of ?-amylase and its genome structures has been known very well, it was used for cloning for this purpose, the genomic DNA of Bacillus circulans ATCC 61 was isolated and the gene encoding α-amylase enzyme was amplified with specific primer by PCR consist of 1400 bp long. The specific primer was designed while detecting the gene belonging to Bacillus α-amylase from gene library. The gel-purified PCR product was inserted into the pGEM®-T Easy vector3015 bp long, which linearized vectors with a single 3´-terminal thymidine at both ends. The T-overhangs at the insertion site greatly improve the efficiency of ligation of A-tailing on the PCR products. Taq DNA polymerase independently generates single deoxyadenosine at both ends of PCR product. Bioinformatics analysis of the cloned gene showed that there is 100% similarity between this gene and amylase gene of Bacillus sp. These results display that the target gene was cloned successfully. Finally for the gene expression, the vector was transferred to JM109 high efficiency E. coli competent cells. This study is the first record in term of the cloning α- amylase enzyme from Bacillus circulans ATCC 61 in the literature.