Doksorubisin kardiyotoksisitesinde oluşan nekrotik hasarda P53 geninin rolü

Abstract

Doksorubisin (Dox), lösemi ve lenfoma gibi farklı kanser türlerine karşı kullanılan geniş spektrumlu antrasiklin türevi bir antibiyotiktir. Kardiyotoksisite, doksorubisinin kullanımını kısıtlayan en önemli yan etkidir. Doksorubisinin oluşturduğu kardiyotoksisite mekanizması tam olarak çözülememekle beraber, en önemli hasarı doksorubisin metabolitlerinin ve serbest oksijen radikallerinin (ROS) yaptığı bilinmektedir. Özellikle ROS'ların etkisiyle hücrede nekroz mekanizmasına ait sinyal yolakları aktifleşmektedir. Bu çalışmada, nekroz mekanizmasındaki Mitokondriyel Transfer Poru'nun (MPTP) açılması sırasında Siklofilin D (CypD) proteinine bağlanarak görev aldığı düşünülen p53 proteininin Dox kardiyotoksitesindeki rolü ve ayrıca MPTP'nin açılmasında regülatör olan CypD proteininin inhibe eden immunosupresant etkili Siklosporin A (CsA)'nın nekroz mekanizmasına ve doksorubisin kardiyotoksisitesine karşı koruyucu etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla kullanılan erkek Sprague-Dawley ratlar dört gruba ayrılmıştır: 1. grup: Kontrol grubu; 2. grup: Tek doz Dox Grubu (10 mg/kg i.p.); 3. grup: Tek doz Dox(10 mg/kg i.p.)+CsA Grubu (3 mg/kg, 7 gün); 4. grup: CsA Grubu (3 mg/kg, 7 gün). Bütün gruplarda Dox ile oluşturulan deneysel kardiyotoksisite sonrası, anestezi altında, kalpler izole edilmiştir. İzole edilen kalpler aorttan kanüle edilerek perfüzyon sistemine takılmıştır ve peristaltik pompa yardımı ile 37oC'ye ısıtılan, karbojen (%5 CO2 ve %95 O2 karışımı) ile havalandırılan Krebs-Henseleit solüsyonu ile perfüze edilmiştir. Kalpte koroner perfüzyon basıncı, sol ventrikül gelişen basıncı (LVDP) ve kalbin dakikadaki kalp atım hızı (KAH), ve sol ventrikül içine yerleştirilen balon ile sol ventrikül gelişen basınç (LVDP) kaydedildi. Ayrıca kalbin kontraksiyon gücünü gösteren sol ventrikül sistolik basınç yükselme hızını ve sol ventrikül diyastolik basınç gevşeme hızını ifade eden LV(dP/dt)max ve LV(dP/dt)min kaydedilmiştir. Yapılan bu farmakolojik deneylere ek olarak, elde edilen dokulardan izole edilen mRNA'lar, cDNA'ya dönüştürülerek Real Time PCR metodu ile p53 geninin ekspresyon seviyesi actb geninin ekspresyon seviyesine bağlı olarak ölçülmüştür ve gruplar arasında karşılaştırılmıştır. Deneyler sonucunda, tek doz Dox (10 mg/kg) verilen grupta kontrol grubuna göre koroner perfüzyon basıncının ve LV(dP/dt)min değerlerinin istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde arttığı (p<0.001); KAH, LVDP ve LV(dp/dt)max değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir biçimde azaldığı (p<0.05) görülmüştür. Buna karşılık Dox+CsA grubunda Dox grubuna göre koroner perfüzyon basıncının ve LV(dp/dt)min değerlerinin istatistiki olarak anlamlı bir şekilde azaldığı (p<0.05); KAH, LVDP ve LV(dp/dt)max değerlerinde ise istatistiki olarak anlamlı bir biçimde arttığı (p<0.001) görülmüştür. Moleküler analizlerde ise p53 geninin ekspresyonunun Dox grubunda kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir biçimde arttığı (p<0.001); Dox+CsA grubunda ise Dox grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığı (p<0.001) görülmüştür.Sonuç olarak Dox grubunda bozulan kalp kontraktilesi ve kalp hemodinamiği ile karakterize kardiyotoksik etkinin CsA ile anlamlı olarak korunduğu ve ayrıca p53 geninin doksorubisine bağlı oluşan nekrotik hasarda görevinin olduğu görülmüştür.

Doxorubicin is a wide spectrum antibiotic that used against various cancers such as lymphoma and leukemia. Cardiotoxicity is the most significant side effects that limit the clinic usage of doxorubicin. Doxorubicin related cardiotoxicity mechanism is not completely explained; however, most of the damage is done by doxorubicin metabolites and reactive oxygen species (ROS). Especially, ROS activates the signaling pathways of necrosis in cell.In this study, the role of p53 expression and the effect of Cyclosporin A in doxorubicin related necrosis have been studied, since CsA is the inhibitor Cyclophilin D protein which is one of the key regulator of necrosis. Male Sprague-Dawley rats were used for this purposes and were divided into four groups: 1. group: Control group; 2. group: Single dose doxorubicin (10 mg/kg i.p.); 3. group: Single dose doxorubicin (10 mg/kg i.p.) + Cyclosporine A (3 mg/kg, 7 days); 4. group: Cyclosporine A (3 mg/kg, 7 days). The hearts were isolated under anesthesia after consisting experimental cardiotoxicity in all groups. The isolated hearts were cannulated through the aorta and attached to the perfusion system that was perfuzed with 37oC carbogen (5% CO2 and 95% O2 mixture) aerated Krebs-Henseleit solution by a peristaltic pump support. Heart coronary perfusion pressure, left ventricular developed pressure (LVDP) and heart rate per minute were compared between the groups. Also LV(dP/dt)max and LV(dP/dt)min which are left ventricular systolic pressure rise rate and left ventricular diastolic pressure relaxation rate were recorded. In addition to this studies, isolated mRNA's from tissue sample which were taken from all groups were transcribed to cDNA and then analyzed with Real Time PCR in order to quantify relative expression levels of p53 gene according to actb gene expression. The expression levels of this gene were compared between groups. Coronary perfusion pressure and LV(dP/dt)min values are statistically significantly increased; and, heart rate, LVDP and LV(dP/dt)max values are statistically significantly decreased (p<0.001) in single dose Dox group (10 mg/kg) according to control group (p<0.05). However, coronary perfusion pressure and LV(dP/dt)min values are statistically significantly decreased (p<0.05); and, heart rate, LVDP and LV(dP/dt)max values are statistically significantly increased in Dox+CsA group (10 mg/kg) according to Dox group (p<0.001). In molecular analysis, it is found that the p53 gene expression is statistically significantly increased in single dose doxorubicin group (10 mg/kg) according to control group (p<0.001). Additionally, the expression of p53 gene is statistically significantly reduced in Dox+CsA group (10 mg/kg) according to Dox group (p<0.001). As a result of this study, the Dox cardiotoxicity which is characterized by the damaged cardiac contractility and cardiac hemodynamics significantly maintained in CsA treated group. Moreover, p53 gene expression has an important role in doxorubicin related necrotic damage.