Oksalat dekarboksilaz enziminin rekombinant DNA teknolojisi ile üretimi ve karakterizasyonu

Abstract

Oksalat taşları üriner sistemde biriken kalsiyum ve oksalik asidin oluşturduğu yapılardır. Oksalat taşları ileri zamanlarda böbrek taşı oluşturur ve erken tanısı için idrar oksalat seviyelerinin ölçülmesi önemlidir. Ülkemizde ve dünyada oksalat seviyeleri oksalat oksidaz ve oksalat dekarboksilaz olmak üzere iki farklı yöntem ile ölçülmektedir. Oksalat oksidaz yönteminde Oksalattan H2O2 ve CO2 açığa çıkarken, Oksalat dekarboksilaz yönteminde reaksiyon sonunda oluşan format'ın format dehidrogenaz enzimiyle parçalandığında açığa çıkan NADH+'nın spektrofotometrik yöntemle ölçülmesiyle oksalat miktarı tayin edilebilmektedir. Bu çalışmada, oksalat dekarboksilaz enziminin rekombinant DNA teknolojisi ile üretimi hedeflenmiştir. Böylece elde edilen rekombinant oksalat dekarboksilaz enzimi ticari olarak satılan format dehidrogenaz enzimi ile birlikte kullanılarak oksalat tayininde kullanılacak bir ölçüm metodunun geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bunun için Basillus subtilis M168 suşundan elde edilen yvrK geni pET SUMO TA Cloning® vektör sistemi ile One Shot® Mach1™-T1R Escherichia coli ve BL21(DE3) One Shot® Escherichia coli mikroorganizmalarına aktarılarak klonlama ve protein ifadesi işlemleri yapılmıştır. Böylelikle elde edilen 6xHis-SUMO-yvrK füzyon proteini başarılı bir şekilde üretilmiştir. Gerekli kofaktör, optimum pH ve sıcaklık sağlanıp karakterizasyonu ve enzim aktivitesi belirtilmiştir. Ayrıca ticari olarak temin edilen format dehidrogenaz enzimi de kullanılarak idrarda oksalat miktarını ölçmekde kullanılabilecek enzimatik aktivitesi yüksek bir oksalat ölçüm metodu geliştirilmiştir.

Oxalate stones are calcium and oxalic acid formed structures that accumulate in urinary system which result in oxalate stone accumulate and kidney stones. Early diagnosis of kidney stones requires measurement of urinere oxalate stone level. Currently there are two different method for measuring oxalate level namely oxalate oxidase and oxalate decarboxylase assay. While, in oxalate method the H2O2 and CO2 produced by oxalate is being measured, oxalate decarboxylase method reveals NADH+ level released from digestion of formate by formate dehydrogenase enzyme so that the level of oxalate stones can be determine. In this study it has been aimed to produce oxalate decarboxylase enzyme by recombinant DNA technology. This produced recombinant oxalate decarboxylase enzyme can be used with commercially available formate dehydrogenase enzyme for measuring oxalate stones as a new method. For this purpose the yvrK gene from Basillus subtilis M168 strain cloned and expressed in One Shot® Mach1™-T1R Escherichia coli and BL21 (DE3) One Shot® Escherichia coli microorganism via pET-SUMO TA Cloning vector system. Thus 6xHis-SUMO-yvrK fussion protein was produced successfully. Requisite cofactor, optimum pH and temperature were provided and characterization was specified. In this way recombinant oxalate decarboxylase enzyme can easily produced and, a method by higher enzymatic activity has been developed to measure oxalate level.