Virüs titresinin hemagglutinasyon testi, plak testi ve real-time RT-PCR ile eş zamanlı olarak belirlenmesi ve test sonuçları arasındaki korelasyonun saptanması

Abstract

Virusların titrasyonu ve enfektivitesi hemagglutinasyon testi, plak testi ve real-time RT-PCR ile belirlenir. Virolojide bu testlerin kullanım alanları çok farklıdır. Hemagglütinasyon testi, tip A influenza virüsleri gibi hemagglütinasyon özelliği gösteren etkenlerini görüntülemek için embriyonlu tavuk yumurtasının amniyoallantoik sıvısı ya da hücre kültürü izolatları kullanılarak yapılan bir testtir. Canlı ve inaktif virüsler HA testiyle tespit edilebilir. Bu test bir dereceye kadar sayısaldır olup 1 hemagglütinasyon ünitesi (HAU) yaklaşık olarak 5-6 log virüse denk gelmektedir. Yapılması ucuz ve nispeten basittir. Birçok faktör (eritrosit kalitesi, laboratuar sıcaklığı, laboratuar donanımı, kullanıcının teknik uzmanlığı) test her çalıştırıldığında yorumlanmasında bir takım farklılıklara neden olabilir.Plak testi, tek tabakalı hücre kültüründe enfeksiyöz virüslerin belirlenmesinde kullanılan en yaygın yöntemdir. Bu testte her enfeksiyöz virüs partikülü plak olarak bilinen enfekte hücrelerin lokalize bir alanı altında çoğalır. Plaklar, genel hücresel boyalar tarafından tespit edilen ölü/yıkılmış hücrelerin alanı olarak ya da immün boyama ile tespit edilen enfekte hücrelerin alanı olarak gözlemlenir.Real-time RT-PCR (rRT-PCR) tekniği rutin gözetim, salgın değerlendirmesi ve araştırma için 2000'li yılların başından beri influenza virüsünün saptanması için kullanılmaktadır. rRT-PCR'ın bazı avantajları: yüksek hassasiyet, yüksek özgüllük, hızlı sonuç verme, ölçeklenebilirlik, maliyeti ve niceliksel niteliğidir. Bununla birlikte, rRT-PCR tavuk embriyolarından ve hücre kültüründen elde edilen virüs izolasyonlarından daha ucuzdur ve çok sayıda numuneye birlikte uygulanabilir. Fakat,influenza virüsünün yüksek genetik değişkenliği, hassasiyeti düşürebilir ve yanlış negatif sonuç olasılığını arttırabilir.Çalışmamızda Influenza A H1N1/pdm/09/California suşu kullanılarak virüs titresinin en doğru şekilde belirlenmesini sağlayacak olan üç farklı yöntemin (hemagglutinasyon testi, plak testi ve realtime RT-PCR) sonuçları arasındaki ilişkinin saptanması ve özellikle enfektivitenin belirlenmesine yönelik uygulanan plak testinde kullanılan farklı metodların karşılaştırılması amaçlanmıştır. Plak testinde agar kaplamanın kullanıldığı yöntemde sıcaklığa duyarlılıkları nedeniyle hücrelerin ölmesi sonuç alınamamasına neden olmuştur. Uygulanan CMC ve Avicell içerikli ortamların ise plak oluşumuna izin verdiği gözlendi. CMC kaplama ortamına kıyasla, Avicel içeren ortamda önemli ölçüde daha büyük plaklar oluştu.Plak boyutu Avicel konsantrasyonunda azalma ile arttı, çok seyreltilmiş Avicel kaplamaları bile lokalize plak oluşumunu sağladı.Sonuç olarak, düşük viskoziteye sahip oldukları için Avicel kaplamaların, özellikle 96 oyuklu kültür plakalarında metilselüloz kaplamalara göre daha kolay kullanılabilir; ayrıca daha hızlı ve daha duyarlı bir yöntem olduğu bulunmuştur.

Virus titration and infectivity are determined by using hemagglutination assay, plaque assay and real-time RT-PCR. These tests are used in various purposes in virology. Hemagglutination assay is carried out to visualize factor showing hemagglutination features by using amnion allontoic fluid or cell culture isolates. It can differentiate live or inactive viruses. HA assay is quantitative test and one unit of hemagglutination (HAU) approximately corresponds to 5-6 log viruses. It is labor friendly and not costly method. Assay results are affected by several factors including erythrocytes, external temperature, laboratory equipments, and expertise of researcher. Plaque test is most commonly used method to determine infectious viruses in monolayer cell culture. In this test each infectious virus particle is proliferate and forms local areas called plaques. Plaques appear as death/destroyed cell areas that can detect with cellular dyes and immunostaining. Real-time RT-PCR (rRT-PCR) has been being used for routine surveillance, epidemic evaluation and research of influenza virus since 2000s. rRT-PCR offers important advantages including high sensitivity and specifity,scalability, low cost, and quantification. In addition, rRT-PCR costs less that chicken embryos and viruses obtained from cell culture and is suitable for working with high number of samples. However, high genetic variation of influenza virus can affect sensitivity and increase possibility of false negative results. In this study, our aims were to determine relationship between results of three methods that is used to determine virus titration (hemagglutination assay, plaque assay and real-time RT-PCR) and to compare different plaque assays that are used for detection of infectivity by using Influenza A H1N1/pdm/09/Californiastrain. Agar coating method in plaque assay resulted in no data because of cell death due to heat-sensitivity of cells. It is observed that mediums containing CMC and Avicel allow plaque formation. Avicel containing mediums allowed bigger plaque formation compared to CMC containing medium. Also with decrease in Avicel concentration plaque size increased. Even highly diluted Avicel coats allowed plaque formation. As a result, we showed that Avicel coats are more suitable for 96-well plate compared to methylcellulose coats due to their low viscosity. Also they provide faster and more sensitive method.