Transnöronal dejenerasyonun hücre kültüründe canlı görüntüleme yöntemi ile araştırılması

Abstract

Sinir sisteminde kısıtlı bir alanda meydana gelen bir hasar öncelikle hasar bölgesindeki hücreleri etkiler ve sonrasında çevre bölgelerde ikincil hasar diye de adlandırılan patolojik bir sürecin başlamasına sebep olur. İkincil hasar, çevredeki hücrelerin ölüm ve dejenerasyonuna sebep olduğunda transnöronal dejenerasyon olarak da adlandırılır. Çalışmamızda bu süreçte rol oynadığı düşünülen P2X7 reseptörü ve hasar sonrası yayılan kalsiyum sinyali, femtosaniye kızılötesi lazer kullanılarak oluşturduğumuz in-vitro hasar modeli ile araştırılmıştır. Hücre kültürü ortamında sınırlı sayıda sinir hücresinde aksotomi hasarı oluşturulduktan 24 saat sonra yapılan canlılık testlerinde ölüm oranının kontrol grubuna kıyasla arttığı ve yalnızca glia hücrelerinde bulunan P2X7 reseptörü bloklandığında ölüm oranın anlamlı bir şekilde kontrol seviyelerine düştüğü gözlenmiştir. Boya alım analizlerinde de hasarın hemen sonrasında çevredeki glia hücrelerinde boya alımının arttığı ve bu artışın hasar bölgesine olan mesafe ile negatif korelasyon gösterdiği gözlenmiştir. P2X7 reseptörü bloklandığında kontrol seviyelerine düşmesi glia hücrelerindeki P2X7 reseptörünün aktivasyonunun hücre zarında büyük bir por açılmasını sağladığını düşündürmüştür. Panneksin1 ve P2X7 boyamaları da aksotomi sonrası komşu hücrelerde bu proteinlerin hücre zarındaki miktarının da zamana bağlı olarak değiştiğini göstermiştir. Kalsiyumun hasar sinyalinin yayılmasındaki etkisinin araştırıldığı deneylerde ise hasarlanan nöronun etrafındaki hücrelerin %4,5 inde kalsiyum artışı olduğu, bu oranın NMDA reseptörü ve oluklu bağlantılar bloklandığında değişmediği fakat NMDA reseptörlerinin bloklanmasının aksotomi sonrası kalsiyum cevabı görülen hücrelerdeki ölüm oranının azalttığı görülmüştür. Tüm bu bulgular transnöronal dejenerasyon sinyalinin yayılmasında gliaların etkin bir rol oynayabileceğini ve P2X7, panneksin1 ve NMDA reseptörlerinin bu süreçte yer aldıklarını ortaya koymuştur.

An injury occurred in limited region of nervous system primarily affects cells at injury region later induces a pathological process in neighboring cells called secondary injury. If secondary injury causes death and degeneration of neighboring cells it's also called transneuronal degeneration. In our study, P2X7 receptor and spreading calcium signal are considered as possible actors in this process and researched using a precise femtosecond infrared laser induced in-vitro injury model. In cell cultures, after limited number of neurons were axotomized, viability tests after 24-hour indicated that total death ratio were increased compared to control and blocking of P2X7 receptors which present only in glial cells, significantly decreased cell death. In dye uptake assays, shortly after axotomies, glial cells showed increased dye uptake level and this increase was negatively correlated with distance to injury region. Blocking of glial P2X7 receptors decreased dye uptake of glial cells to control levels and this make us thought that P2X7 receptors may open a large pore on the cell membrane. Immunocytochemistry indicated that the amount of P2X7 and Pannexin1 channels in cell membranes of neighboring cells were also changed time dependently after injury. Experiments testing the effect of the spreading calcium signal in response to injury indicated that 4.5% of neighboring neurons were showed calcium increase as a response to axotomy. Inhibition of NMDA receptors and gap junctions didn't alter this ratio but inhibition of NMDA receptors decreased death ratio of the neighboring neurons which showed increased levels of calcium in response to axotomy. All of these findings indicated that glial cells may have an active role in spreading of transneuronal degeneration signal and P2X7, Pannexin1 and NMDA receptors are involved in the process.