OXA-1/N266 ve OXA-320/I266 β-laktamaz varyantlarının karşılaştırmalı biyokimyasal karakterizasyonu ve mutasyonel analizi (OXA/A266)

Abstract

Bu tez kapsamında yakın zamanda tespit edilen D-Sınıfı β-laktamaz grubuna ait iki adet OXA alelinin (blaOXA-1 ve blaOXA-320) ekspresyon vektörlerinde rekombinant olarak ifade edilmesi ve hem minimum inhibisyon konsantrasyonunun belirlenmesi (MIK) hem saflaştırılan proteinlerin karşılaştırmalı olarak karakterizasyonu amaçlanmıştır. Böylelikle, OXA-tipi β-laktamazların allelik farklılıklarına bağlı olarak antibiyotik tedavilere cevap vermedeki değişimler araştırılmıştır. Her iki alel birbirinden tek bir aminoasit farklılık gösteren enzimleri kodlarlar. OXA-1 proteininde 266. pozisyonda asparajin (266N) aminoasiti mevcutken, OXA-320 proteininde aynı noktada izolösin aminoasiti (266I) bulunmaktadır. Her bir alelin MIK değerlerine bakılması için TOPO100 ekspresyon vektörüne ve kinetik karakterizasyonuna bakılması için pET28a vektörüne klonlanarak rekombinant olarak üretilmeleri sağlandı. Aynı zamanda 266. pozisyondaki aminoasit varyasyonun etkisini araştırmak için bu noktada alanin mutasyonu gerçekleştirildi. Rekombinant protein üretimi E. coli BL21 hücrelerinde gerçekleştirildi ve Ni-afinite kromotografi yöntemi ile saflaştırılarak kinetik karakterizasyon deneylerinde kullanıldı. Kinetik sonuçlarına göre OXA-1, OXA-320 ve OXA1/266A enzimlerinin β-laktam antibiyotikleri hidroliz etmeleri açısından aralarında büyük farkların olmadığı gözlemlendi. Üç enziminde meropenem ve seftazidimi hidroliz etmedikleri, benzilpenisilini ve sefepimi çok az hidroliz ettiği, en iyi ise sefalotini ise iyi hidroliz ettiği belirlendi. MIC sonuçlarına göre, amoksisilin ve piperasilin antibiyotiğine OXA-1, OXA-320 ve OXA320/266A örneklerinin direnç sağladığı, monobaktam grubu antibiyotiğe ve karbapenem grubu antibiyotiklere karşı direnç oluşturmadığı tespit edildi. MIK sonuçlarına paralel olarak OXA alelleri arasında β-laktam antibiyotiklere karşı katalitik etkide çok az farklılıklar görüldü.Anahtar Kelimeler: blaOXA-1, blaOXA-320, MIK

In this master thesis, it was aimed to express of two blaOXA alleles (blaOXA-1 and blaOXA-320) classified in Class-D β-lactamase on expression vector and then to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) and comparatively characterization of the prufied recombinant protein. Thus, it was investigated the effect of amino acid changes in each variants related to enzyme activity. Each protein has a single amino acid changes from each other. While OXA-1 protein has asparagine (266N) at residue 266, OXA-320 protein has isoleucine (266I) at the same position. Each allele was separately cloned into TOPO-100 expression vector to determine the MIC and pET28a expression vector for kinetic characterization. Besides this, site-directed mutagenesis was used to make alanine mutation at residue 266 (266A) to evaluate the effect of mutation on enzyme activity. Recombinat protein was produced in E. coli BL21 cell and purified by Ni-afiinity chromotography and they were used to kinetic characterization. According to kinetic results, there was no big difference about hidrolysis activity of each variant (OXA-1, OXA-320 ve OXA1/266A) on β-lactam antibiotics. It was found no hydrolysis on meropenem and seftazidime, weak hidrolysis on benzylpenicilline and sefepime and strong hydrolysis on sefalothin for each variant. According to MIC results, each variant generates resistance to piperacilline and they could not affect to monobactams and carbapenems. In accordance with MIC values, it was determined small differences among their kinetic activity on β-lactam antibiotics of these two OXA variants and their alanin mutant. Keywords: blaOXA-1, blaOXA-320, , MIC