Escherichia coli replikatif DNA polimeraz IIIα (DnaE)` ye inhibisyon etkili bitki organ özütlerinde fenolik bileşiklerin HPLC-DAD ile aydınlatılması

Abstract

Bu yüksek lisans tezinde 11 bitkinin replikatif DNA polimeraz inhibisyonu, antimikrobial aktivite ve bazı kimysal içerikleri çalışılmıştır. Bitkilerden bazılarının tamamı, bazılarının meyve, yaprak, çiçek kısımları kullanıldı. Replikatif bakteriyal DNA polimeraz olarak Escherichia coli (E. coli) replikatif DNA polimeraz IIIα (DnaE) seçildi ve rekombinant üretildi. Bunun için DnaE'i kodlayan gen PZR ile çoğaltıldı ve pET-100 TOPO vektörüne klonlandı. Ni-afinite ile saflaştırıldı. 11 bitkinin metanol ve DMSO özütleri hazırlandı. Metanol özütleri DnaE karşı inhibisyonun belirlenmesi için primer uzatma deneylerinde kullanıldı. Bu amaçla sentetik olarak dizayn edilen ve florojenik primer ihtiva eden 45/20-mer DNA kullanıldı. Rosa canina bitkisinin çiçek kısmının DnaE üzerinde güçlü bir şekilde inhibisyon gösterdiği belirlendi. Sorbus caucasica ve Sorbus aucuparia bitkilerin yaprak ve meyvelerinin de inhibisyon gösterdiği belirlendi. Sorbus aucuparia (meyve, yaprak), Sorbus caucasica (meyve, yaprak) ve Rosa canina (çiçek, meyve) DMSO ekstraktlarının gram (+) ve gram (-) bakteriler üzerine antimikrobiyal testi yapıldı. Sorbus türlerinin ekstraktlarında gram (+) bakteriler üzerinde antimikrobiyal aktivitesi olmadığı gözlendi. Rosa canina meyve özütlerinin gram (+) ve gram(-) olmak üzere bu iki grup bakteri üzerinde antimikrobiyal aktivitesi olduğu belirlendi. İnhibisyon görülen bitkilerin metanol ekstraktları sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemi ile sulu ortamda sırasıyla dietil eter, etil asetat, bütanol ve kalan sulu kısım olmak üzere dört ayrı fraksiyona ayrıldı ve ardından HPLC-DAD ile bu ekstraktların fenolik bileşikleri aydınlatıldı. Rosa canina bitkisinin çiçek ve meyve özütlerinde gallik asit ve gallik asitin türevi olan ellacik asit bulundu. Sorbus aucuparia ve Sorbus causacisa bitkilerinin yaprak ve meyve özütlerinde klorojenik asit ve rutin bileşikleri bulundu.

Inhibition of replicative bacterial DNA polymerase, antimicrobial activity and chemical compounds of eleven plants were investigated in this Master Thesis. The whole or some parts (such as leaf, flower and fruit) of plants were used in assay. E. coli replicative DNA polymerase IIIα (DnaE2) was selected to research inhibition affects of plant compounds and it was produced as recombinant. The gene coding DnaE2 was amplified from E. coli K12 genom by PCR and inserted into the pET100-TOPO expression vector. It was expressed in E. coli BL21 (DE3) and purified by Ni-affinity chromorography. Methanol and DMSO extracts of eleven plant samples were prepared. Methanol extracts were used to investigate their inhibitory affect on polymerase by primer extension assay and DMSO extracts were used to investigate the antimicrobial activity on selective microorganisms by agar diffusion methods. Flourogenic labeled 45/20-mer synthetic DNA used in primer extension assay. According to results, a strong inhibition against to DnaE2 was determined in flower exract of Rosa canina. At the same way, it was determined that Sorbus caucasica and Sorbus aucuparia had the same affect on DnaE2. Antimicrobial activity of Sorbus aucuparia (fruit and leaf), Sorbus caucasica (fruit and leaf) and Rosa canina (flower and fruit) was investigated for Gram (-) and Gram (+) microorganisms. There was no antimicrobial affects in Sorbus extract against to Gram (+), but fruit extract of Rosa canina had antimicrobial affect against to both Gram (+) and Gram (-). The plant extracts having inhibitory affect on DnaE2 was fractioned into four sub-fractions (in order to dietyl eter, etyl acetate, butanol and liquid part) by liquid-liquid extraction method prepared in water and then phenolic compounds in each fraction were identified by HPLC-DAD system. Gallic acid and its derivate (ellagic acid) were found in flower and fruit extracts of Rosa canina. Clorogenic and rutin compounds were found in leaf and fruit extract of Sorbus aucuparia and Sorbus caucasica.