Anoxybacillus gonensis yaban tip ve W137/V184S mutantı glukoz izomerazlarının DEAE-sefaroz matriksina kovalent ve non-ko0valent immobilizasyonu

Abstract

Glukoz izomeraz (GI) (D-ksiloz ketol izomeraz; EC 5.3.1.5), amilaz ve proteaz ile birlikte dünyanın en yüksek tonajlı üç enziminden birisidir. GI'nın D-glukozun D-fruktoza izomerizasyonu HFCS (yüksek fruktoz içerikli hububat şurubu) üretiminde ticari bir öneme sahiptir. Bu öneminden dolayı bugüne kadar pek çok hücreden yeni GI'lar izole edilerek karakterize edilmiştir. Endüstriyel uygulamalar için GI'ın maliyetinin azaltılması ile ilgili birçok yaklaşım araştırılmış ve uygulama alanı bulmuş olmakla birlikte, bu yaklaşımlardan en fazla tercih edilen GI'nın immobilize edilerek tekrar tekrar kullanılmasıdır. Bu çalışmada, saflaştırılan Anoxybacillus gonensis G2T glukoz izomerazının (AgoGI) ve bu enzimin W137F/V184S mutantının DEAE-Sepharoz matriksine iyonik ve kovalent immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Daha sonra immobilize enzimlerin biyokimyasal ve kinetik parametreleri belirlenmiştir. Enzimlerin hem iyonik hem de kovalent immobilizasyonu sonrası optimum çalışma sıcaklıkları 85°C olarak, optimum pH değerleri ise 6,5 olarak belirlenmiştir. AgoGI'nın iyonik ve kovalent olarak DEAE-Sefaroza immobilize edilmiş hallerinin Km değerleri sırasıyla 130,57 ± 5,42 mM ve 127,28 ± 2,96 mM; Vmax değerleri ise 0,10136 ± 0,0014 µmol/dk ve 0,03985 ± 0,0003 µmol/dk olarak hesaplandı. Enzimin W137F/V184S mutantının iyonik ve kovalent olarak DEAE-sefaroza immobilize edilmiş hallerinin Km değerleri sırasıyla 37,44 ± 2,09 mM ve 39,93 ± 2,02 mM; Vmax değerleri ise 0,0641 ± 0,0008 µmol/dk ve 0,06408± 0,0007 µmol/dk olarak belirlendi.

Glucose isomerase (GI) (D-xylose ketol isomerase, EC 5.3.1.5) is the one of the three highest tonnage enzymes with amylase and protease in the World enzyme market. The isomerization of D-glucose to D-fructose has commercially importance to produce high fructose corn syrup (HFCS). Therefore, various GIs have been isolated and characterized from different microorganisms and macroorganisms up to day. Besides, Many procedures have been researched and applied to reduce the cost of GI for industrial applications. The most preferred procedure among the applied procedures has been determined as reuse of GI via enzyme immobilization. In this study, we carried out ionically and covalently immobilizations of both wild type and double mutant enzymes of Anoxybacillus gonensis G2T on DEAE-sepharose matrix. Then, biochemical and kinetic parameters of immobilized enzymes were determined. The optimum temperature and pH value was determined as 85°C and 6,5 for all the enzymes, respectively. According to the results of kinetic studies, Km and Vmax values of ionically and covalently immobilized AgoG1on DEAE-Sepharose were 130,57 ± 5,42 mM and 127,28 ± 2,96 mM and 0,10136 ± 0,0014 µmol/min, 0,03985 ± 0,0003 µmol/min, respectively. Km and Vmax values of ionically and covalently immobilized AgoG1with double mutation (W137F/V184S) on DEAE-Sepharose were 37,44 ± 2,09 mM, 39,93 ± 2,02 mM and 0,0641 ± 0,0008 µmol/min, 0,06408 ± 0,0007 µmol/min respectively.