Keratinaz üreten bakterilerin izolasyonu ve enzim üretiminin moleküler yöntemlerle arttırılması

Abstract

Bu çalışmada, Çukurova Üniversitesi Tavukçuluk Ünitesi'nden toplanan ve tavuk tüyü içeren toprak örneklerinden üç adet keratinolitik Bacillus sp. izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Bakteriler sırasıyla Bacillus sp. MK1, MK2 ve MK3 olarak isimlendirilmişlerdir. MK1 ve MK3 keratinazları optimum aktivitelerini 40°C'de gösterirken, MK2 keratinazı 50 ºC'de göstermiştir. Yine MK1 ve MK3 keratinazları optimum aktivitelerini pH 9.0'da, MK2 keratinazı ise pH 8.0'de göstermiştir. MK1, MK2 ve MK3 bakterilerinin keratinazlarına ait spesifik aktiviteler 40 °C'de sırasıyla 2.76, 0.77 ve 5.48 U/mg protein olarak gerçekleşmiştir. En yüksek düzeyde enzim üretimini inokülasyondan itibaren MK1 izolatı 36., MK2 ve MK3 izolatları ise 24-36. saatlerde gerçekleştirmişlerdir. İzolatların EtBr ile muamelesi sonucunda MK1'den MK1-M3, MK1-M4 ve MK1-M5, MK2'den MK2-M3 ve MK2-M4, MK3'den ise MK3-M1, MK3-M3, MK3-M4 ve MK3-M5 aşırı üretici mutant varyeteleri elde edilmiştir. MK1-M3, MK1-M4, MK1-M5, MK2-M3, MK2-M4, MK3-M1, MK3-M3, MK3-M4 ve MK3-M5 mutant varyeteleri kendi yabani tip suşlarına göre sırasıyla %186, 117, 133, 144, 171, 122, 116, 214 ve 187 oranında enzim üretmişlerdir. PMSF, üre, CaCl2, Tween 80 her üç enzim için de ortak aktivatör olarak belirlenmiştir. EDTA ise her üç enzimi de inhibe etmiştir. BLAST analizleri sonucunda Bacillus sp. MK1 bakterisi B. subtilis NCDO 1769 ile %96 oranında rDNA sekans benzerliği göstermiştir. Diğer taraftan Bacillus sp. MK2 ve MK3 bakterileri ise B. subtilis NRRL B-4219 ve B. tequilensis 10b bakterileri ile %99, B. subtilis SBMP4 bakterisi ile de %98 oranında rDNA sekans benzerliği göstermişlerdir.

In the present study, three keratinolytic Bacillus strains were isolated from the feather containing soil samples collected from the poultry enterprise of Çukurova University. The isolates were entitled as Bacillus sp. MK1, MK2, and MK3, respectively. The optimum enzyme activities were observed at 40°C for MK1 and MK3 keratinases whereas 50 ºC for MK2 keratinase. Similarly, optimum pH value for MK1 and MK3 keratinase was 9.0, whereas 8.0 for MK2 keratinase. The specific activities of MK1, MK2, and MK3 keratinases were 2.76, 0.77 and 5.48 U/mg protein at 40°C, respectively. Maximum enzyme productions of isolates were observed after 36 hours for MK1, and 24-36 hours for MK2, and MK3. Over-expressing mutant varieties MK1-M3, MK1-M4 and MK1-M5 from MK1, MK2-M3 and MK2-M4 from MK2, and MK3-M1, MK3-M3, MK3-M4 and MK3-M5 from MK3 were obtained after EtBr treatment. MK1-M3, MK1-M4, MK1-M5, MK2-M3, MK2-M4, MK3-M1, MK3-M3, MK3-M4 and MK3-M5 have produced 186, 117, 133, 144, 171, 122, 116, 214 and %187 keratinase according to their own wild type strains, respectively. PMSF, urea, CaCl2 and Tween 80 were determined common activators for all enzymes. However, EDTA has also inhibited all these three enzymes. According to BLAST analysis, Bacillus sp. MK1 rDNA sequence was similar to B. subtilis NCDO 1769 rDNA sequence at the rate of 96%. On the other hand, Bacillus sp. MK2 and MK3 rDNA sequences were similar to B. subtilis NRRL B-4219 and B. tequilensis 10b rDNA sequences at the rate of 99%, and B. subtilis SBMP4 rDNA sequence at the rate of 98%.