A Small scale purification procedure for EcoRI endonuclease

Abstract

ÖZET Rekombinant DNA teknolojisi veya genetik mühendisliği doğada var olan mikroorganizma, bitki ve hayvanların genetik malzemelerinin değiştirilmesini, yani DNA'lar ının rekombinasyonu yoluyla bilinçli olarak yeni mikroorganizma, bitki ve hayvan türlerinin türetilmesin! kapsamaktadır. DNA moleküllerinin kesilmesi ve birbirine eklenmesi rekombinant DNA oluşturma yönteminin başlıca işlemleridir. Bu işlemler, bakteriden özütlenerek alınan restriksiyon enzimleri ve ligazlar kullanılarak yapılmaktadır. Bu araştırmada restriksiyon enzimleri için bir saflaştırma yöntemi geliştirilmesi amaçlanmış ve en yaygın olarak kullanılan EcoRI endonükleazı model sistemi olarak seçilmiştir. EcoRI üretimi için ufak ölçekli bir saflaştırma yöntemi geliştirilmiştir. pPG430 plasmidini içeren E.coli 294 susu kullanılarak elde edilen EcoRI endonükieazınıı. saflaştırma yöntemi, kaynaklarda bulunan çeşitli yöntemlerin değerlendirilerek değiştirilmesi, iyileştirilmesi ve laboratuar koşullarına uygun hale getirilmesi ile sağlanmıştır. Geliştirilen yöntem, hücre üretimi, hücre ozütlerinin hazırlanması ve sırasıyla, fosfoselüloz, hidroksiapatit ve tekrar fosfoseluloz kromatografilerinin uygulanmasından oluşan aşamalarda enzimin saflaştırılmasından ibarettir.Elde edilen endonükleazın saflık derecesi SDS-poliakrilamid gel elekroforezi kullanılarak belirlenmiştir. Enzimin çözelti içinde tetramer ve dimer formunda bulunabileceği gözlenmiş ve tetramer formu için 116,000, dimer formu için 58,000, molekül ağırlıkları saptanmıştır. Geliştirilen yöntem kullanılarak gerçekleştirilen saflaştırma sonucunda birim yaş hücreden 5,800 ünite EcoRI elde edilmiştir ve bu enzimin hacimsel aktivitesi mikrolitrede 20 ünite, toplam spesifik aktivitesi ise 32,680 ünite olarak saptanmıştır.

IV ABSTRACT Recombinant DNA technology or genetic engineering has permitted the manipulation on the genetic material of microorganisms,plant and animal species and the insertion of new genetic information into living cells. The ability to introduce a segment of foreign DNA by recombinant DNA technology depends extremely on the isolation and fermentation of the source DNA and incorporation of this fragment into a cloning vector by the use of restriction enzymes and Hgases to cut and to rejoin DNA molecules, respectively. In this study, the aim was to develop a model system for the purification of restriction enzymes. EeoRl endonuelease, which is a common restriction enzyme, was chosen as a sample restriction endonuelease to develop a small scale purification procedure.Escherichia coli strain 294 containing the plasmid pPG430 was used as the source of EcoRl. The procedure for the purification was developed by modifying, improving and adapting the techniques available in the literature. The experimental procedure developed consists of several stages including cell growth, preparation of cell extract,and successive application of phosphocellulose and hydroxyapatite chromatography. The purity of the isolated protein was tested by using the SDS-polyacrlamide gel electrophoresis,, where a single band was observed. This single band can exist in either one of the two forms in solution, as the M= 116000 or the M- 58000 which may refer to tetramer and dimer forms of EcoRl respectively. The recovery of 5800 units of EcoRl per gram wet cells was achieved by using the procedure developed. The volumetric and the specific activities of the purified enzyme was found as 20 unit per microliter and 32,680 unit respective!}'..