A Study of growth and instability of recombinant E.coli in free-suspension and immobilized cell cultures

Abstract

ÖZET Rekombinant DNA teknolojisinin endüstriye uygulanması sırasında karşılaşılan önemli problemlerden biri uzun büyüme süreci içinde rekombinant plazmidin stabil olmamasıdır. Bu tez çalışmasında, Ecoli HB101 bakterisine yerleştirilmiş olan YEp352 adlı plazmidin stabilitesi, farklı büyüme ortamlarında karşılaştırılmıştır. Kültür ortamının, sıcaklık, kesikli ve sürekli büyüme ortamlarının ve hücrenin alginat jelinden yapılan küreciklere tutuklanmasının etkileri araştırılmıştır. Plazmidi taşıyan ve plazmidsiz bakteri türlerinin büyüme parametreleri karşılaştırıldığında, plazmidsiz olanının büyüme hızının, bütün besi yerlerinde, bir miktar daha fazla olduğu görülmüştür. Başlangıcında yaptığımız deneyler, bu plazmidin.büyüme hızının yavaş olduğu minimal besi ortamında dahi uzun bir süre büyütülmesine rağmen stabil kaldığını göstermiştir. Bu sonuçlardan sonra, bakterinin kalsiyum-alginat matriksine tutuklanmasının plazmid stabilitesine etkisini incelemek için, ekim işleminde iki tür bakteriyi içeren karışım (belli oranlarda plazmid-taşıyan ve plazmidsiz bakteri kültürlerinin karışımı) kullanılmaya başlanmıştır. Bu şartlar altında hücrelerin tutuklanması rekombinant plazmidin bakteri kültüründen kayıbolmasını belirgin olarak geciktirdi. Plazmid-taşıyan bakterilerin yüzdesi süspansiyon hücre kültürlerinde hızla azalırken, tutuklanmış hücre kültürlerinde bu oran sabit kaldı.

ABSTRACT One major problem in the industrial applications of recombinant DNA technology which tends to get lost from the culture, is the instability of the recombinant plasmid over a long period of cultivation. In this thesis work, we compared the stability of the plasmid YEp352 in the bacterial host Meal/ HB101 under different culture conditions: influence of culture medium, temperature, batch and continuous culture conditions and cell immobilization in alginate beads were investigated. The comparision of the growth parameters of the same bacterial strain carrying or not the plasmid showed that in every culture conditions the bacteria without the plasmid had a slightly higher growth rate. Our initial experiments showed that this plasmid was stable for long period of time even when the bacteria were cultured in a minimal medium where their growth rate was low. This prompted us to use a mixed inoculum (containing a proportion of plasmid-free cells) to study the effect of cell immobilization in Calcium- alginate matrix on plasmid stability. IVUnder these conditions, immobilization of the cells significantly retarded the loss of the recombinant pi as mid from the bacterial culture. The percentage of the plasmid-carrying cells remained constant in immobilized cultures while this percentage was decreasing sharply in free-suspension cell cultures.