Osteosarkom hücreleri üzerinde statinlerin ve vitamin D`nin etkilerinin araştırılması

Abstract

Ergenlik dönemi ile ileri yaşlardaki bireyleri hedef alan ve sağkalım oranları günümüz teknolojisine rağmen %60-70 oranlarında seyreden osteosarkom yüksek dereceli primer kemik malignitelerinden biridir. Non-spesifik şikayetler ile başvuran hastaların %30'unda teşhis konulduğu anda metastatik lezyonlar izlenmesine ek olarak bu hastaların 5 yıllık sağkalım oranları %20 civarındadır. Farklı kanser türlerinde etkili olan ajanların metastaz potansiyeli yüksek osteosarkom vakalarında da faydalı olup olmayacağı sorusu araştırmacı ve klinisyenleri bu ilaçların farklı hücresel mekanizmalar üzerindeki etkilerini anlamaya yöneltmiştir. Bu etkiler açısından ele alınabilecek ilaçlar arasında statinler de yer almaktadır. Statinler birçok kanser türünde anti-metastatik ve anti-proliferatif etkiler göstermektedir. Benzer şekilde vitamin D'nin de anti-kanser etkiler gösterdiği bilinmektedir. Çalışmadaki amacımız bu iki ajanın MG-63 osteosarkom hücrelerinde TNF- varlığında/yokluğunda ölüm yolakları üzerindeki tek başına ve kombine etkilerini araştırmaktır. Çalışmamızda MG-63 hücreleri, farklı dozlarda atorvastatin (5, 10 ve 50 µM), TNF- (20 ng/mL) ve/veya vitamin D (10-6 M) varlığında 24 ve 48 saat süreyle kültüre edilmiştir. 24 saat kültürden sonra otofajik, apoptotik ve endoplazmikretikulum (ER) stres yolaklarında yer alan proteinlerin ekspresyon düzeyleri qPCR ve akım sitometre analizleri ile, kemik matriks proteini olanosteokalsin'inmRNA seviyeleriqPCR, osteokalsin ve kollajen-1'in protein düzeyleriimmunositokimyasal boyamalar ile değerlendirilmiştir. 24-48 saat sonunda hücre canlılığı ve laktatdehidrojenaz (LDH) düzeyleri ölçülmüş, tedavi süresi boyunca hücrelerin gerçek zamanlı görüntüleri alınarak morfolojik değişiklikler incelenmiştir. Ayrıca, 48. saatte alkalenfosfataz (ALP) aktivitesi saptanmıştır. Çalışma sonuçlarımıza göre atorvastatin otofajik ve apoptotik yolakta yer alan proteinlerin ve ER stres belirteçlerinin ekpresyonlarınıuyararak MG-63 hücrelerinin canlılığını azaltmış ve matriks protein yıkımına yol açan enzimlerin ekspresyonunu arttırmıştır. Vitamin D MG-63 hücrelerinde ölüm yolakları üzerinde atorvastatin ile birlikte uygulandığında bu yolaklarda mevcut proteinlerin ekspresyonu üzerine atorvastatinin etkilerini zayıflatmıştır. Sonuç olarak, vitamin D'nin osteoblast-osteosit farklılaşmasına yönelik olası etkileri üzerindenatorvastatin ile antagonist etki oluşturabileceğini ve bu nedenle bu ajanların kombine halde verileceği tedavilerde dikkatli olunması gerektiğini düşünmekteyiz.

Osteosarcoma is one of the high-grade primary bone malignancies that target adolescence and older individuals and have a survival rate of 60-70% despite current technology. In addition to the presence of metastatic lesions in 30% of patients with non-specific complaints at the time of diagnosis, the 5-year survival rate of these patients is around 20%.The question of whether agents that are effective in different types of cancers will also be useful in cases of osteosarcoma with high metastatic potential has led researchers and clinicians to understand the effects of these drugs on different cellular mechanisms.Statins are among these drugs with such various effects. They have anti-metastatic and anti-proliferative effects in many cancer types. Similarly, vitamin D is known to have anti-cancer effects.The aim of this study was to investigate the effects of these two agents on death pathways (alone and in combination) in the presence/absence of TNF- in MG-63 osteosarcoma cells.In our study, MG-63 cells were cultured in the presence of different doses of atorvastatin (5, 10 and 50 µM), TNF (20 ng/mL) and/or vitamin D (10-6 M)for 24 and 48 hours.After 24 hours of culture, expression levels of proteins in autophagic, apoptotic and endoplasmic reticulum (ER) stress pathways were evaluated by qPCR and flow cytometer analysis. Osteocalcin expressions of bone matrix protein was evaluated by qPCR in mRNA and by immunocytochemical staining in protein levels of osteocalcin and collagen-1. Cell viability and lactate dehydrogenase (LDH) levels were measured at the end of 24-48 hours. Real-time images and morphological changes of the cells were examined during treatment. In addition, alkaline phosphatase (ALP) activity was determined at 48 hours.According to our results, atorvastatin decreased the viability of MG-63 cells by stimulating the expression of autophagic and apoptotic pathway proteins and ER stress markers and increased expression of the enzymes leading to matrix protein degradation.When vitamin D was co-administered with atorvastatin, it weakened the effects of atorvastatin on expression of proteins present in death pathways in MG-63 cells.In conclusion, we think that vitamin D might be antagonizing atorvastatin over its possible effects on osteoblast-osteocyte differentiation and therefore, we suggest that caution should be exercised in the treatment of these agents in combination.