Paraoksonaz Q ve R izoenzimlerinin saflaştırılması ve bazı çevre kirleticilere karşı afinitesinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, detoksifikasyon ve antioksidan aktivitesi ile metabolizmada önemli fizyolojik fonksiyona sahip paraoksonaz (PON1) Q ve R izoenzimlerini saflaştırmak için yeni bir hidrofobik etkileşim kromatografisi jeli sentezlenmiştir. Hidrofobik etkileşim kromatografisi jeli, CNBr ile aktive edilmiş Sepharose-4B'ye uzantı kolu olarak L-tirozin bağlandıktan sonra ligand olarak hidrofobik bir molekül olan 9-aminofenantrenin L-tirozine kenetlenmesi sonucu sentezlenmiştir.Sentezlenen hidrofobik etkileşim jeli ile uygulanan hidrofobik etkileşim kromatografisi ve amonyum sülfat çöktürmesi yöntemleri kullanılarak insan serumundan Q ve R izoenzimleri ayrı ayrı saflaştırılmıştır. Saflaştırılan PON1Q ve R izoenzimleri SDS poliakrilamid jel elektroforezine uygulanarak yaklaşık 43 kDa molekül ağırlığına sahip tek bant elde edilmiştir.İnsan serum PON1 enziminin paraokson substratına karşı KM ve Vmax değerleri Linewear-Burk yöntemi ile Q izoenzimi için 0,599 mM ve 55 U/mL, R izoenzimi için 0,492 mM ve 50 U/mL olarak bulunmuştur.Bu çalışmada Mn, Hg, Co, Cd, Ni ve Cu ile purtapyr, agroform, practucer ve roundup ticari isimleriyle kullanılan bazı çevre kirleticilerin saflaştırılmış PON1192Q ve PON1192R izoenzimleri üzerindeki in vitro etkisi belirlenmiştir. Söz konusu çevre kirleticilerinin bu izoenzimlerden R tipini daha fazla inhibe ettiği saptanmıştır.

In this study, a new gel of hydrophobic interaction chromatography for purification of paraoxonase (PON1) Q and R izoenzyme, which are of important physiological function in metabolism with detoxification and antioxidant activity, were synthesized. The gel was synthesized with Sepharose-4B-L-tyrosine and 9-aminophenantrene as hydrophobic ligand. Sepharose-4B was activated with CNBr and than L-tyrosine was added as extension arm.Human serum paraoxonase was purified with ammonium sulfate precipitation and with synthesized hydrophobic interaction chromatography. On SDS-polyacyrilamide gel electrophoresis, purified human serum paraoxonase yielded a single band of 43kDa on SDS-PAGE.The KM and Vmax values were determined by the method of Lineweaver-Burk plots, using paraoxon as substrate. The KM and Vmax were 0.599mM and 55 U/ml for Q izoenzyme, 0.492 mM ve 50 U/mL for R izoenzyme respectively.The effect of some environmental pollutants on purified human serum PON1192Q and PON1192R in vitro was determined. The pollutants were Mn, Hg, Co, Cd, Ni, Cu, purtapyr, agroform, practucer, roundup. All of them caused an inhibition effect on purified human serum paraoxonase in vitro. In addition, the inhibition of paraoxonase activity for R izoenzyme by these pollutants was more than that of R izoenzyme.