Possible involvement of apoptosis during neural transdifferentiation of bone marrow derived human mesenchymal stem cells by N3 cytokine combination

Abstract

Apoptoz, normal işlevli insan ve hayvan hücrelerinde, hücre sağlığının durumu veya yaşı ve durumu gerektiğinde hücre çekirdeği tarafından sinyallenen programlı bir hücre ölümüdür. Apoptoz, in vivo'da gelişen organların şekillenmesi ve hücresel iç dengenin düzenlenmesinde önemli bir araç olmasına rağmen in vitro'daki nöral farklılaşma için istenmeyen bir süreçtir ve nöral tetikleyiciler buna sebep olabilir. Kök hücreler, sinir hücrelerini de içeren farklı hücre türlerine trans-farklılaşabilir. Kök hücrelerin trans-farklılaşma süreci apoptoz ve sitotoksisite açısından nöral tetikleyiciler tarafından etkilenebilir. Bu çalışmada insan kemik iliği mezankimal kök hücreleri (iMKH) üzerinde N3 sitokin kombinasyonuyla olan nöral farklılaşmanın sitotoksik ve apoptotik etkileri çalışıldı. Yakın zamandaki çalışmalara göre, topoizomeraz IIß (topo IIß) nöral farklılaşmada rol alabilmektedir. Kök hücrelerin trans-farklılaşma süreci primer nöron hücrelerin farklılaşmasından daha farklıdır. Bunun için, topo IIß'nın kök hücrelerin transdifferensiyasyon işleminde primer hücrelerin farklılaşmasındakinden farklı davranması muhtemeldir. Buna dayanarak, Lipofectamine RNAiMAX transfeksiyon maddesinin güvenilirliğine açıklık kazandırmak amacıyla nöral farklılaşmada topo IIß'ya özel kısa interferanslar (siRNAs) ile beraber Lipofectamine RNAiMAX transfeksiyon maddesi de kullanıldı. Daha sonra, Lipofectamine RNAiMAX transfeksiyon maddesinin iMKH'ler üzerinde sitotoksisite ve apoptoz etkisi incelendi. Deneysel düzenlenme göz önüne alınarak iMKH'ler farklılaşma için N3 sitokin kombinasyonu ile indüklendi ve siRNA transfeksiyonu gerçekleştirildi. Gerçek Zamanlı Hücre Analizi (RTCA) ve apoptoz deneyleri uygulandı. N3 sitokin kombinasyonu ile nöral farklılaşmadan sonra, iMKH'lerin N3 sitokin kombinasyonu ile nöral farklılaşma verimi morfolojideki değişikliklere göre yaklaşık olarak %70±10 bulundu. siRNA ile baskılanan nöral hücrelerde akson uzunluğu siRNA uygulanmayan hücrelere göre daha kısadır (55±5). Ayrıca, iMKH'ler Annexin ve Caspase 3 testleri ile tanımlandığı gibi 2nci, 6ncı ve14üncü günde apoptoza girmedi. Fakat 14üncü günde %10±2, %13±1 ve %15± nekrotik hücreler sırasıyla indüksiyon, transfeksiyon ve indüksiyonla beraber transfeksiyon grubunda gözlemlenmiştir. 2nci ve 6ncı günde önemsiz sayıda hücreler, nekrotik bir işaretleyici (marker) olan Sytox Green ile gözlendiği üzere nekroza girmişlerdir.

Apoptosis is the programmed cell death as signalled by the nuclei in normally functioning human and animal cells when age or state of cell health and condition dictates. Although apoptosis is an important tool to shape developing organs and for maintaining cellular homeostasis in vivo, for neural differentiation in vitro it is an undesirable process and it may be caused by neural inducers. Stem cells can transdifferentiate into different cell types including neuronal cells. The transdifferentiation process of stem cells might be affected by neural inducers in terms of apoptosis and cytotoxicity. In this study, we investigated the cytotoxic and apoptotic effects of neural differentiation by N3 cytokine combination (Neurobasal Medium, B-27 Supplement, dbcAMP, IBMX, hEGF, rhFGF, FGF-8, rhBDNF and L-Glutamine) on bone marrow human mesenchymal stem cells (hMSCs). According to recent studies, topoisomerase IIß (topo IIß) may play a role in neuronal transdifferentiation. The transdifferentiation process of stem cells appears to be different substantially from the terminal differentiation of granule neurons. Therefore, the functional significance of topo IIß may also be different in these differentiation systems. So, topo IIß specific small interference RNAs (siRNAs) with Lipofectamine RNAiMAX transfection reagent was also used during neural differentiation to investigate the safeness of Lipofectamine RNAiMAX transfection reagent. Then, the cytotoxicity and cell proliferation effect of Lipofectamine RNAiMAX transfection reagent on hMSCs was tested. Considering the experimental layout, hMSCs were induced by N3 cytokine combination for differentiation and siRNA transfection was performed. Next, Real Time Cell Analysis (RTCA) and apoptosis assays were carried out. After neural differentiation by N3 cytokine combination, neural differentiation efficiency of hMSCs by N3 cytokine combination was found nearly 70±10% according to changes in morphology. The axon length in siRNA transfected neural cells was shorter (55±5) than untransfected neural cells. Next, hMSCs did not undergo apoptosis at the 2nd, 6th and14th day as determined by the Annexin and Caspase 3 assays. However, at the end of the 14th day, 10±2%, 13±1% and 15±4% necrotic cells were indicated in induction, transfection and transfection with induction group, respectively. At the 2nd and 6th day insignificant percentage of cells entered necrosis as monitored by the necrotic marker Sytox Green.