Investigation of cis- elements on coding sequence involved in regulation of Stem-Loop Binding Protein (SLBP) in G1

Abstract

İnsan hücrelerinde, hücre döngüsünün S fazında, genetik materyal olan DNA replike edilir ve yeni sentezlenen DNA histon oktamerleri adı verilen proteinkompleksleri etrafına sarmalanır. Kısıtlı bir zaman içerisinde çok fazla miktarda histonprotein üretilmesi, histon mRNA seviyesindeki artıştan, histon mRNA seviyesinde ki artış ise mRNA işlenmesinin artmasından kaynaklanmaktadır. SLBP, histon mRNA işlenmesi ve translasyonu için gerekli bir proteindir. Hücre döngüsüne bağlı olarakdüzenlenir ve S fazında en yüksek seviyeye ulaşır. G1 fazının sonlarına doğru SLBPprotein seviyesi 10-20 kat artar, S fazı sonunda ise yıkılır. Önceki çalışmalarda,SLBP'nin G1 fazındaki regülasyonunu açıklığa kavuşturmak amacı ile translasyon etkinliğine bakılmıştır. Translasyon seviyesi G1'in ortalarında S faz seviyesineulaş masına rağmen, G1'in geç safhalarına kadar SLBP protein seviyesinin düşük olduğu gözlemlenmiştir. Bu da SLBP proteinini G1 fazında düşük seviyede tutan ekstra bir regülasyona işaret etmektedir. ilaveten, G1 fazındaki SLBP proteinin stabilitesinin Sfazı ile kar?ıla?tırıldığında daha düşük olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, SLBP'yiG1'de dü?ük seviyede tutan muhtemel mekanizma ; yeni sentezlenen SLBP proteinlerinin hızlı bir şekilde degrade olmasıdır. Bu çalışmada, bahsi geçen proteinyıkımından sorumlu olan kısımlarının aydınlatılması için, SLBP proteininin kodlanmasından sorumlu bölgelerde farklı delesyonlara sahip konstraktlar kullanarak stabil hücre hatlarını oluşturdum. Ek olarak, SLBP'nin G1 fazındaki ekspresyonundaki rolünü anlamak için yapılan çalışmalarda kullanılmak üzere, G1 fazında aktif olduğu bilinen E3 ligaz APC/Cdh1'ın hedef motifi olan kodlayıcı dizi bölgesini mutasyon ile değişime uğratarak yeni bir konstrakt hazırladım.

In the S phase of human cell cycle, the genetic material, DNA, is replicated andthe newly synthesized DNA is wrapped around a protein core, called histone octamer.Production of large quantities of histones in a limited time is due to a large increase inthe amount of the histone mRNA. Increased histone mRNA levels are primarily due toan increase in the processing of the histone mRNAs. Stem-Loop Binding Protein(SLBP) is a crucial protein for histone mRNA processing and translation. It is cell cycleregulated and its level is highest during S phase. SLBP protein is increased 10 to 20 foldin the late G1 and then degraded in the S/G2 border. Previously, translation efficiency istested in order to clarify the regulation of SLBP in G1. Although the level of SLBPtranslation increases to S phase level in mid-G1, the amount of the SLBP proteinremains low until late G1 or G1/S border. This suggests that there is another regulationthat keeps the SLBP level low. Further it is shown that the SLBP protein is less stable inG1 in comparison to S phase, so the possible mechanism that keeps the level of SLBPlow is rapid degradation of newly synthesized SLBP in mid-G1. In this study, in orderto find out the coding sequence region(s) that are responsible for this degradation, Igenerated cell lines that are stably expressing different deletion mutants of SLBP.Further, since APC/Cdh1 is known as the active E3 ligase in G1, I mutated a putativeAPC target site in SLBP as a tool to investigate its role in G1 regulation of SLBPexpression.