Genç ve yaşlı deri fibroblast hücrelerarası kuvvetlerinin, HP (high throughput) bioforce sistem ile, biyofiziksel ve ultrastrüktürel düzeyde değerlendirilmesi ve CTGF, colLA1, MMP1 gen ifadelerinin karşılaştırılması

Abstract

Mekanik tansiyon hücrelerde gen ifadesi, hücre metabolizması, hücresel tansiyon ve hücreler arasında tansiyon aktarımı gibi bir çok hücresel süreci etkilemektedir. HP Bioforce sistemi in vitro hücre kuvvetlerinin ölçümü için geliştirilen yeni bir teknolojidir. Bu sistem silikon ince membran üzerindeki hücre ya da doku tabakalarını mikrometre garalığında indükleyen küçük miktarlarda kuvvetler oluşturur.Thrombin endotelyal hücreler ve stres fiberlerinde tansiyonu, endotelyal hücre bariyer geçirgenliğini arttırdığı iyi bilinen bir enzimdir. Hücresel kuvvetlerin ölçümleri ile ilgili önceki çalışmalarda thrombin, hücre kontraktil tansiyonunu arttırıcı bir faktör olması sebebi ile bu çalışmalarda pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. TGF-β ise doku yenilenmesi ve matriks formasyonundaki önemi sebebiyle sıklıkla çalışılan bir sitokinindir. TGF-β'nın ayrıca fibroblast kontraktilisini arttırdığı bilinen α-smooth muscle aktin (α-SMA) ifadesini de düzenlediği düşünülmektedir.Bu çalışmada HP Bioforce sistemi kullanılarak monolayer olarak kültive edilen yaşlı ve genç dermal fibroblastlar arasında thrombin, TGF β ve içeriği bilinmeyen beş farklı substansın uygulandığı monolayer yaşlı ve genç dermal fibroblast hücre grupları arasındaki hücresel kuvvetler ölçüldü. Çalışmanın ikinci aşamasında ise genç (18, 29 yaş) ve yaşlı (59, 73 yaş) dermal fibroblast hücre gruplarında ekspresyonu farklı olacağı düşünülen kollagenaz enzimi geni MMP1, kollajen tip 1 alfa proteinini sentezleyen COL1A1, bağ doku faktörü olan CTFG gen ekspresyonları gerçek zamanlı PCR tekniği ile incelenmiştir.Sonuçlara göre thrombin genç hücrelerde hücresel kuvvetleri TGF beta'nın ise yaşlı hücrelerde hücresel kuvvetleri önemli ölçüde arttırdığı sonucuna ulaşılmıştır. Yapılan gen ifadeleri çalışmalarında ΔΔCt formülü kullanılarak yapılan hesaplama sonucunda ise yaşlı hücrelere göre genç hücrelerde MMP1 gen ifadesinin 1,71 kat azaldığı, COL1A1 gen ifadesinin 1,89 kat arttığı ve CTGF gen ifadesinin 1,53 oranında azaldığı gözlenmiştir.

Mechanical tension impacts a multitude of cellular processes including signal transduction, gene expression, cellular tension and cell tension transmission between cells, and cell metabolism. The HP Bioforce System is an innovative instrument used for measurement of the in vitro cell forces in thin film tissue constructs. This system creates the quantification of small forces and induces thin cell or tissue layers in μm – range.Thrombin is well-known to increase tension in endothelial cells and stress fibers, and increase endothelial cell barrier permeability. Thrombin is used as a positive control in previous studies since it is a biological factor known to stimulate cell contractile tension. TGF-β is an extensively studied cytokineon the basis of its importance in wound healing and matrix formation and possibly in regulating a-SMA expression.The first aim of this project was to find the differences in cellular forces between human young and old dermal fibroblasts without any application of substances and between human young and old dermal fibroblasts following application of thrombin (1U/mL), TGF beta (20 ng/mL) and five different substances, using HP-Bioforce screening system. The second aim of this project was to find the differences in the expression of MMP1, CTFG and COL1A1 genes which were considered to have different expressions between human dermal fibroblasts derived from young (18,29 years old) and elderly (59, 73 years old) donors, using Real Time PCR analysis system.Thrombin increases significantly the cell forces in young cells than old cells. On the contrary, TGF beta increases significantly the cell forces in old cells than young cells. The relative gene expressions were calculated by ΔΔCt formula and the results gained from the comparison of the young dermal skin cell lines and the old dermal skin cell lines demonstrated that there has been 1,71 -fold decrease in MMP1, 1,89-fold increase in COL1A1, 1,53-fold decrease in CTGF, respectively.