Echinococcus granulosus`un in vitro çoğaltma özellikleri ve protoskolekslerle ifadesi ile aktif gen çok yapılığın (polimorfizm) araştırılması

Abstract

Echinococcus granulosus''/m İn Vitro Çoğalma Özellikleri ve Protoskolekslerde Aktin Gen İfadesi ile Aktin Gen Çokyapılılığın (Polimorfizm) Araştırılması Kistik ekinokokkozis veya hidadit kist hastalığı, Echinococcus granulosus parazitinin larval formunun sebep olduğu bir hastalıktır. Dünya çapında pek çok ülkede insan sağlığı bakımından olduğu kadar ekonomik bakımdan da tehdit oluşturan bu hastalığın kesin tedavisi de olmadığı için hala önemini ve güncelliğini korumaktadır. Sunulan çalışmada E. granulosus parazitinin in vitro koşullarda larval gelişiminin tanımlanması, protoskoleks ve germinatif membranın hücresel organizasyonunun ortaya konulması, aktin genlerinin (Egactl ve II) protoskolekslerdeki ifadesinin tespiti ile aktin genlerinin gen çok yapılılığın (polimorfizm) ortaya konulması hedeflendi. Aktin proteininin hücre iskeletinin ana bileşeni olması ve hücre iskeletinin de organizmaların gelişim ve farklılaşma süreçlerinde, hücrelerde meydana gelen her türlü morfolojik değişikliklerde anahtar rol oynaması nedeniyle aktin geni hedef gen olarak seçildi. Aktin genlerindeki olası çeşitliliğin kist gelişimi, farklılaşması, patogenezisi ve konak tercihi gibi özelliklerde farklılıklara yol açabileceği düşünüldüğü için bu genlerdeki çok yapılılığın ortaya konulması planlandı. Çalışmada Konya ve çevresi ile Karapınar' dan temin edilen koyun tutulumlu 38 farklı kiste ait protoskoleks ile S.Ü.Meram Tıp Fakültesi Cerrahi Anabilim Dalında ameliyat sonucu temin edilen insan tutulumlu l kiste ait protoskoleksler çalışıldı. Protoskoleksler 3-4 kez yıkama solüsyonları ile yıkandı ve ışık mikroskobunda canlılık oranı araştırıldı. Canlılık oranı %80-100 arasında tespit edilen protoskolekslerin bir kısmı kültüre edildi kalan kısmı ise -80°C 'de kullanılıncaya kadar depolandı. Kültür süresince protoskolekslerin gelişimi inverted ışık mikroskobu ile takip edildi ve fotoğraftandı. Protoskolekslerin ve germinatif membranlann hücresel 85 organizasyonunu ortaya koymada ise ışık mikroskobu kullanıldı. DNA ve RNA izolasyonları -80°C'de depolanan protoskolekslerden TRizol reagent (Gibco, BRL) kullanılarakbaşarıldı.Primerler,GenBankasından(NCBI) (http://www.ncbi.nmi.nih.gov/entrez/viewer) temin edilen Egactl ve II genlerinin nükleotid dizileri dikkate alınarak tasarlandı. RT-PZR tekniği kullanılarak hedef genlerin protoskolekslerdeki ifadeleri tespit edildi. PZR-RFLP tekniği ile bu gen bölgeleri çoğaltıldı ve PstI, Alul ve Taql enzimleri kullanılarak olası çeşitlilik araştırıldı. Kesim ürünleri agaroz jel elektroforezde yürütülerek sonuçlan değerlendirildi. İn vitro kültür şartlarında E. granulosus' un protoskoleksten mikrokist yönündeki gelişimi başarıyla tamamlandı. Bu gelişim boyunca gözlemlenen başlangıç, vakuolizasyon, mikrokist öncesi ve mikrokist safhaları literatürle uyumlu bulundu. Parazitlerin in vitro kültür çalışmaları, özellikle konak dokusu obuadan sadece paraziti gözlemlemek ve gelişimini daha iyi anlamak bakımından önemlidir. Gelişmenin farklı aşamalarında kültürü durdurmak ve bu aşamalarda sentezlenen genleri çalışabilmek, ilaç etkinliği çalışmaları, aşı geliştirme çalışmaları ve gelişmeyi kontrol eden mekanizmalara müdahale edebilme şansı E. granulosus kültürünün önemini ve etkin bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir. Bu çalışmada E. granulosus protoskoleks ve germinatif membranın hücresel organizasyonu da tanımlandı. Parazitin morfolojisini daha iyi anlayabilmek için yapılan bu çalışmada protoskolekslerin vantuzlar da dahil olmak üzere tüm vücut yüzeyini kaplayan tegümentin tamamen hücrelerden oluştuğu, çengellerin ise hücresel bir yapısının olmadığı gözlendi. Germinatif zar hücrelerinin çok yoğun olmadığı ancak yer yer hücresel odakların bulunduğu tespit edildi. Hücresel odakların bulunması, bu bölgelerden protoskolekslerin tomurcuklanması yönünde bir hazırlık olabileceğini düşündürmektedir. Sunulan çalışmanın diğer bölümünde, RT-PZR analizlerini takiben yapılan agaroz jel elektroforez sonuçlarına göre protoskolekslerde aktin 2 (Egact2) geninin ifade edildiği ve Aktin l (Egactl) geninin ifade edilmediği tespit edildi. PZR-RFLP analizleri sonucunda ise Egactl ve Egactll genlerinde iki örnekte nükleotid değişikliği olduğu ve sadece bur örnekte heterozigotluğun bulunduğu tespit edildi. E. granulosus' da kendi kendine döllenme (self-fertilizasyon) sisteminin yaygın olması, tür içinde homozigotluğun hakim olmasına ve heterozigotluğun kaybolmasına yol açmaktadır. Ayrıca çalışılan tüm örneklerde aktin I genindeki Alul enzimi tanıma bölgelerinden birinin olmadığı tespit edildi. Bu çalışmada analizi yapılan protoskolekslerdeki genomik yapının Anadolu koyun türüne özgün olabileceği ve Gen Bankasında mevcut olan diziden farklı bir genomik yapı gösteriyor olabileceği düşünülmektedir. Üstelik bu çalışmada aktin I gen bölgesinin allelik gen çokyapılıhğı 86gösterdiği de tespit edilmiştir. Bugüne kadar yapılan çalışmalarda E. granulosus'da allelik gen çok yapılılığının çok nadir olduğu rapor edilmişti. Hücrelerin çoğalması ve farklılaşmasında etkin rol oynadığı bilinen aktin genlerinde görülen bu çeşitlilik ve allelik gen çok yapılılığının, kist hidatiğin büyüme ve gelişmesini etkileyebileceği düşünülmektedir. Bu çalışmada elde edilen sonuçların ışığında E. granulosus aktin genlerinin, aşı geliştirme çalışmaları için aday gen olabileceği ve epidemiyolojik çalışmalarda türler arası ve tür içi genetik çeşitliliğin belirlenmesinde moleküler belirleyici olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.

the morphology and the development of cyst hydatid to give Anatolian strain. As a result, the actin genes can be used as molecular markers for epidemiologic studies and strain identification. 90the incubation, the samples were suspended for 30 min in hypotonic solution and fixed in methanolrasetic acid (3:1). Preparations were stained with 5% Giemsa and observed by light microscope. For the molecular analysis, total RNA and genomic DNA were exracted from protoscoleces obtained 39 different cysts using TRIzol Reagent (Gibco, BRL) according to the manufacturers instructions. Differences in mRNAs of Egactl weEgactll genes were determined using RT-PCR techniques. The PCR analysis was carried out using specific primers which were designed according to nucleotide sequence of Egactl and Egacfll genes obtained from the GenBankT through the National Center for Biothecnology Information (NCBI). Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of this target genes was performed using the restriction enzymes PstI, Alul and Taql. Restriction products were analysed by agarose gel electrophoresis. As a result, in vitro larval development from protoscoleces to microcyst was succesfully completed. We observed four different stage; initial, vacuolization, premicrocyst and microcyst. In vitro cultures has been a useful and very advantagous approach such as determine the parasite tissue without host tissue, investigate stage-specific gene expression and localization of gene pruducts, applications of chemotherapeutecs. In this study we determined the cellular organization of protoscoleces and germinative membranes. We observed all the tegumental surface of the protoscoleces is composed of cells and the germinative membranes are cell clusters. We suggest that the protoscoleces can be emerge from the cellular clusters of germinal layer. In this study the results of the RT-PCR analyses indicate that Egactll was expressed in protoscoleces but Egactl was not. As a result, we detect the nucleotide variations at two loci for the actinl and II genes within the sheep strain. The variations of Gl strain lead to the lowest intermediate host specificity and the wider geographic distribution. In this study we observed the heterozygosity at only one loci. An increase in homozygosty and loss of heterozygosity within populations of E. granulosus is well explained by self-fertilization. In E. granulosus populations, both selfing and outcrossing fertilization is occur but cross-fertilization is rare. In our study we detected the loss of one of the Alul enzyme recognition sites of the actin I genes in all samples. We concluded that this genomic structure may be spesific to Anatolian sheep strain and genetically distinct from other existing gene in the GenBankT database. In this study allelic polymorphism was also found in the actin I gene although the degree of allele polymorphism detected within strains of E. granulosus was low in the previous studies. It's known that the actin proteins are suggested to act as key molecules in the process of cell differentiation and proliferation. This nucleotide variation and allelic polymorphism of actin genes may affect 89the morphology and the development of cyst hydatid to give Anatolian strain. As a result, the actin genes can be used as molecular markers for epidemiologic studies and strain identification. 90