Acinetobacter baumannii kökenli beta-laktamaz OXA-23 geninin klonlanması ve enzim karakterizasyonu

Abstract

Acinetobacter baumannii yoğun bakım ünitelerinde sıklıkla izole edilen klinik önemi olan fırsatçı bir patojendir. Acinetobacter türlerinde görülen karbapenem direnci çoğu kez karbapenem hidroliz eden beta-laktamaz (karbapenemaz) genlerinin varlığı ve yaygınlığı ile alakalıdır. Acinetobacter'lerde karbapenem direncine sebep olan OXA-23 (ARI-1) bir karbapenemaz olup 1985'te İskoçya'da tanımlanmış daha sonra dünyanın birçok bölgesinde tespit edilmiştir. Kocaeli Üniversitesi yoğun bakım ünitesinde salgın etkeni Acinetobacter baumannii türü izolatlarda blaOXA-23 geni klonlanarak tespit edilmiştir. blaOXA-23 geni ve bu genin flanking bölgeleri tespit edilen bu klona pAc-KOU1 adı verilmiştir. Yapılan dizi analizinde genin ISAba1 transpozonu üzerinde olduğu belirlenmiştir. Bu güne kadar dünyanın çeşitli bölgelerinde blaOXA-23 geni tanımlanmasına karşın bu genin ürünü olan OXA-23 enzimi saflaştırılmamış ve kinetik özellikleri belirlenmemiştir. Bu çalışmada OXA-23 enzimini aktif halde saflaştırmak ve kinetik parametrelerini tanımlamak istedik. Ön denemeler OXA-23'ün klasik protein saflaştırma metodları olan amonyum sülfat çöktürmesi, sıcaklık inaktivasyonu ve iyon değiştirici kromatografi ile saflaştırılamayacağını gösterdi. Bu nedenle OXA-23 füzyonla E.coli maltoz bağlama proteinine eklendi ve tek adımda amiloz kolon maddesi üzerinden saflaştırıldı. Saf protein ile imipenem, meropenem, sefepim, seftazidim, ampisilin, piperasilin, penisilin G ve nitrosefin hidrolizi çalışıldı. Aynı zamanda klavulanik asit, sulbaktam ve tazobaktam ile enzim aktivitesini yarıya indiren inhibitör konsantrasyonları belirlendi. OXA-23 enziminin yüzey yük dağılımı, füzyon haldeki konformasyonu ve topolojik özellikleri enzimin kendine has özelliklerinin ortaya çıkarılması için yapılan bir model üzerinde incelendi.Anahtar sözcükler: Acinetobacter, beta-laktamaz, OXA-23'ün saflaştırılması, enzim kinetiği

Acinetobacter baumannii is the most common isolated opportunistic pathogen that is frequently involved in outbreaks of infection. Carbapenem resistance which are observed in Acinetobacter spp. is mostly related to carbapenem hydrolyzing beta-lactamase genes and their prevalence. OXA-23 (ARI-1) responsible for carbapenem resistance in Acinetobacter spp. was first described in Scotland in 1985 and then isolated in many other parts of the world. blaOXA-23 gene and its? flanking region was detected by cloning in Acinetobacter baumannii isolated from Kocaeli University intensive care unit. The clone was named pAc-KOU1. Sequence analysis showed that this gene is located on ISAba1 transpozon. Although blaOXA-23 is defined in many parts of the world, the enzyme has not been purified. We, thus, aimed to purify and characterize of OXA-23 protein and determine its kinetic properties. Preliminary results showed that classic protein purification methods including ammonium sulphate precipitation, heat inactivation and ion exchange chromatography were not efficient for purification of OXA-23. Therefore, blaOXA-23 gene was cloned into pMal-c4x to fuse the enzyme with maltose binding protein in E. coli. Recombinant protein was purified in a single step. Pure protein was used for imipenem, meropenem, cefepime, ceftazidime, ampisiline, piperasilin, penisilin G and nitrocefin hydrolysis. Also clavulanic acid, tazobactam and sulbactam concentration that inhibit 50 % of OXA-23 enzyme activity was calculated. Modelling of OXA-23 revealed its ionic surface structure, conformation in the fused form and its topology.Key words: Acinetobacter spp., beta-lactamase, OXA-23 purification, enzyme kinetics